海藻糖衍生物DMBT抗肿瘤侵袭转移作用的研究

摘要

肿瘤侵袭与转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征，也是临床肿瘤患者（90％以上）死亡的最主要原因。目前临床缺乏有效抗肿瘤侵袭和转移的药物，研制抗侵袭转移药物已经成为肿瘤化疗亟待解决的问题。肿瘤侵袭转移涉及的步骤主要有:肿瘤细胞在原发灶增殖及血管生成，细胞间粘附性改变而从原发部位脱落，分泌的蛋白水解酶和胶原酶降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和基底膜，侵入血管或淋巴管，迁移至靶器官通过增殖和血管生成形成一个新的癌灶。其中，抑制蛋白水解酶的活性和血管生成是抗肿瘤侵袭转移的重要切入点。
　　近几十年来，天然产物已成为创新药物和药物先导化合物发现的重要源泉，具有抗肿瘤侵袭转移活性的天然活性物质的结构优化是发现抗肿瘤转移创新药物的重要途径。海藻糖衍生物Brartemicin是日本科学家Igarashi从放线菌(Actinomycete)Nonomuraeasp.代谢产物中分离得到的，结构为6，6'-双-2，4-二羟基-6-甲基苯甲酸酯-α，α-D-海藻糖。Brartemicin对结肠癌Colon26-L5细胞具有较强的抗侵袭能力，且毒性低。课题组为获得活性更优的抗肿瘤侵袭转移的药物，对Brartemicin的分子进行优化设计，构建了结构多样性的海藻糖衍生物。经筛选和活性比较，发现化合物6，6'-双（2，3-二甲氧基苯甲酰基）-α，α-D-海藻糖(6，6'-bis(2，3-dimethoxybenzoyl)-a，a-D-trehalose，DMBT)具有较强的抗肿瘤侵袭转移活性。其对结肠癌Colon26-L5细胞的抗侵袭活性比天然产物Brartemicin更高，IC50为0.15μM(0.10μg/mL)。本课题主要通过体内、外实验，研究DMBT对人乳腺癌细胞和鼠黑色素瘤细胞抗侵袭转移的作用，在进一步确证化合物DMBT抗肿瘤侵袭转移活性的基础上，探讨其作用机制，为开发高效低毒具有我国自主知识产权的抗肿瘤侵袭转移药物奠定基础。
　　体外实验:MTT及台盼蓝染色实验显示，DMBT在64μM时对MDA-MB-231细胞的抑制率低于30％，对B16BL6细胞的抑制率也低于30％，说明DMBT对细胞增殖和细胞活力无明显影响。迁移实验和划痕实验显示，2-8μMDMBT能显著抑制肿瘤细胞的迁移。Transwell侵袭实验显示，2、4μMDMBT能显著抑制MDA-MB-231和B16BL6细胞的侵袭。小管形成实验显示，4、8μMDMBT能显著抑制HUVEC细胞的管形成。Westernblotting及明胶酶谱实验结果显示，DMBT可抑制MDA-MB-231和B16BL6细胞的MMP-9、VEGF的表达。在MDA-MB-231细胞中，DMBT可降低VEGFR2、p-VEGFR2及p-EGFR的表达，引起下游p-AKT表达降低。在B16BL6细胞中，DMBT可抑制PI3Kp110α、p-AKT、p-GSK-3β、p-mTOR、mTOR的表达。Real-timePCR实验结果显示，DMBT可引起GSK-3βmRNA表达升高、降低VEGFA、AKT1、PI3Kr1mRNA表达。
　　体内实验:尾静脉注射B16BL6细胞至C57BL/6J小鼠体内构建人工肺转移模型，结果显示，与对照组相比，给药14天后，DMBT在1mg/kg、10mg/kg可显著抑制肿瘤细胞的肺转移，且无明显毒副作用。尾静脉分别注射生物发光细胞B16-F10-luc-G5和MDA-MB-231-luc-D2L2HN细胞至Balb/c-nu裸鼠体内构建人工肺转移模型，结果显示，与对照组相比，给药11天后，DMBT在1mg/kg、10mg/kg可显著抑制肿瘤细胞的肺转移。鸡胚尿囊膜血管形成实验显示，DMBT在10mg/ml时能显著抑制鸡胚尿囊膜血管生成。
　　结论:海藻糖衍生物DMBT具有抗肿瘤细胞侵袭转移的活性，且对细胞毒性较低。通过影响MMP-9/VEGF、VEGFR2或EGFR来引起下游AKT/GSK-3β/mTOR通路起到抗侵袭转移的作用。因此，DMBT以其高效低毒的特点有潜力成为抗侵袭转移的候选药物之一。