海藻糖衍生物DMBT对湿性老年黄斑变性的作用及机制研究

摘要

老年黄斑变性是世界范围内老年群体最常见的致盲疾病。脉络膜新生血管是湿性老年黄斑变性的的主要标志，也是最主要的致盲原因。人眼底感光细胞和视网膜色素上皮细胞与上层视网膜血管隔开，由下层脉络膜血管供养，单层紧密排列的视网膜色素上皮细胞即血-视网膜屏障起到保护感光细胞和物质转换等作用。视网膜缺氧导致的视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)增多，作用在邻近的脉络膜血管内皮细胞上，促使其增殖、迁移、形成新生血管是眼底新生血管类疾病的共同病理特点，新生血管会吸收光，一方面引起视物变形，另一方面不成熟的新生血管会出现出血和渗出，最终导致失明。如何抑制低氧条件下视网膜色素上皮细胞过量分泌的VEGF是治疗脉络膜血管新生的关键。我院药化所刘兆鹏教授以日本科学家Igarashi从放线菌Nonomuraea代谢产物中分离得到的活性化合物Brartemicin为先导化合物，设计合成多组海藻糖类的衍生物，并对这些化合物进行了初步活性筛选。发现6，6'-双（2，3-二甲氧基苯甲酰基）-α，α-D-海藻糖(6，6'-bis(2，3-dimethoxybenzoyl)-α，α-D-trehalose，DMBT，M=670.61 g/mol)的体外抗肿瘤血管新生的活性比Brartemicin的更强。前期研究发现，DMBT的毒性较低，能通过下调肿瘤细胞中VEGF和p-VEGF的表达，抑制内皮细胞小管形成和迁移的能力，具有较强的体内抗肿瘤血管新生的活性，并且能抑制鸡胚尿囊膜血管生成，这提示该化合物对于眼底血管新生类疾病可能也有作用。但DMBT对脉络膜血管新生是否有作用还不清楚。本课题通过体内外实验，研究化合物DMBT对湿性老年黄斑变性即脉络膜血管新生的治疗作用，并研究其分子机制，为得到高效低毒、具有我国自主知识产权的治疗湿性老年黄斑变性的药物奠定基础。
　　利用MTT实验检测化合物DMBT在2-128μmol/L时对ARPE-19和RF/6A细胞的抑制率，结果显示抑制率均低于20％，而且8-32μmol/L DMBT对细胞增殖和细胞活力无明显影响。划痕实验和管形成实验显示，在缺氧微环境中，使用含有8和32μmol/L DMBT的ARPE-19细胞条件培养基对RF/6A细胞进行培养，与无条件培养基的RF/6A培养组相比，能够明显抑制RF/6A细胞的迁移和管形成，说明DMBT可能通过作用于ARPE-19细胞影响RF/6A细胞的迁移和管形成。532 nm激光损伤C57BL/6小鼠眼底脉络膜，构建小鼠脉络膜血管损伤模型。脉络膜lectin488荧光染色结果显示，与阴性对照组相比，玻璃体内注射0.2和1mmol/L DMBT1μL，可以显著抑制脉络膜血管的新生且无明显毒副作用。ELISA实验检测ARPE-19细胞分泌到细胞外的血管内皮生长因子VEGF的水平，结果发现8和32μmol/L的DMBT能抑制由于缺氧导致的ARPE细胞分泌的VEGF的量的升高且具有剂量依赖性，活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)也可以在一定程度上影响VEGF的分泌。Western blotting实验显示，DMBT给药组降低了模型鼠视网膜中VEGF蛋白的表达。表明DMBT在体内外都可以抑制视网膜色素上皮细胞对VEGF的分泌。通过活性氧试剂盒检测发现8和32μmol/L DMBT能抑制由于缺氧所导致的活性氧的升高。提示DMBT可能通过活性氧相关的通路降低VEGF的分泌。Western blotting实验结果显示，32μmol/LDMBT能抑制ARPE-19细胞在缺氧微环境中细胞内上调的p-ERK1/2，核内Nrf2，HO-1和HIF-1α蛋白的表达，这进一步表明DMBT作用机制与抑制细胞活性氧相关。另外ELISA检测发现500μmol/L的NAC对ARPE-19细胞分泌VEGF的作用弱于32μmol/L的DMBT，说明DMBT对VEGF表达的影响不只与活性氧有关，接下来我们利用Western blotting检测了DMBT对p-Akt和p-NF-κB的表达的影响，发现DMBT能抑制p-Akt和p-NF-κB的表达。
　　结论:海藻糖衍生物DMBT在缺氧状态下，能够通过对视网膜色素上皮细胞的作用，间接抑制脉络膜血管新生，且细胞毒性较低。通过影响ERK1/2/Nrf2和Akt/NF-κB活性氧依赖通路影响下游HIF-1α的表达，抑制VEGF的分泌。从而起到抑制脉络膜血管新生的作用。由此DMBT以其高效低毒的特点有潜力成为抗脉络膜血管新生类疾病的候选化合物之一。

目录

声明

摘要

符号说明

1．老年黄斑变性的现状

2．脉络膜血管新生

2．1 视网膜脉络膜复合结构

2．2 VEGF与CNV和AMD

2．3 缺氧、活性氧与CNV

2．4 对于脉络膜血管新生当下治疗

3．海藻糖衍生物

1．1 化合物

1．2 细胞株

1．3 试剂

1．4 动物实验

1．5 仪器设备

2．实验方法

2．1 细胞培养

2．2 MTT法检测化合物DMBT对视网膜色素上皮ARPE-19细胞以及脉络膜内皮RF／6A细胞增殖的影响

2．3 缺氧微环境中DMBT对RF／6A细胞以及条件培养基下的RF／6A细胞管形成能力的影响

2．4 ELISA实验检测缺氧微环境中DMBT对ARPE-19细胞分泌到细胞外的VEGF因子的影响

2．5 缺氧微环境中DMBT对ARPE-19细胞内活性氧的影响

2．6 Western blotting检测缺氧微环境中DMBT对ARPE-19细胞内相关因子表达的影响

2．7 C57小鼠激光脉络膜损伤模型的建立和药物的注射

2．8 脉络膜铺片染色

2．9 Western blotting检测DMBT对小鼠视网膜内相关因子的分泌

2．10 统计学方法

实验结果

1．2 缺氧状态下DMBT和ARPE-19细胞条件培养基对RF／6A细胞迁移和管形成作用的影响

1．3 玻璃体内注射DMBT对激光损伤小鼠脉络膜血管新生模型血管新生面积的影响

1．4 缺氧状态下DMBT对ARPE-19细胞分泌到细胞外的血管内皮生长因子VEGF的影响

1．5 玻璃体内注射DMBT对激光损伤小鼠脉络膜血管新生模型视网膜中血管生长因子VEGF的影响

1．6 缺氧条件下检测DMBT对ARPE-19细胞分泌的VEGF与细胞内活性氧之间的关系

1．7 Western blotting检测缺氧状态下DMBT对于ARPE-19细胞相关蛋白表达的影响

1．8 Western blotting检测缺氧状态下DMBT对于ARPE-19细胞p-Akt和p-NF-κB表达的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文