利用重组大肠杆菌生产PHB-co-PHBV嵌段共聚物的研究

摘要

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物天然合成的一类功能性生物聚酯，由于PHA具有与传统石油化工类塑料相似的材料性质，因此PHA一直以来都被认为是传统石化类塑料的最佳替代品。PHA材料具有良好的生物可降解性、生物相容性、光学活性和压电性等，在日常生活、医疗卫生、农业生产、燃料供给以及仪器配件等方面都有广泛的应用前景。
　　聚羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)是短链PHA家族的两个成员，是目前研究比较透彻的两种PHA聚酯。PHB是由同一种单体（3-羟基丁酸）聚合而成的，而PHBV是由两种单体（3-羟基丁酸和3-羟基戊酸）共聚而成的，因此PHBV的材料学性能比PHB有了很大提高。但是由于PHBV是随机共聚物，其结晶过程会呈现同二晶现象，对加工过程非常不利。而嵌段共聚物不同于随机共聚物，能够避免同二晶现象。由于嵌段共聚物分子量可控、分子量分布较窄、分子结构与组成可设计、性能更优越，因此是高分子研究领域中最富有意义且具有挑战性的研究工作之一。本论文的研究目的就是在重组大肠杆菌中，利用合成生物学的设计和调控，生产PHB-co-PHBV嵌段共聚物。
　　本研究的第一部分是构建嵌段共聚物生产的基础菌株。实验室之前的研究表明，重组大肠杆菌可以利用非相关碳源，如葡萄糖、木糖等，经过苏氨酸代谢途径，合成3HV含量较高的PHBV。本论文以此为基础，在大肠杆菌的基因组上，对天冬氨酸激酶thrA进行了点突变和启动子替换，解除了苏氨酸的反馈抑制，使该途径的转录水平提高了11倍以上，苏氨酸的积累能力提高了9.5倍，能够为嵌段共聚物的生产提供足够的底物。随后，我们利用本实验室构建的Flp/FRT位点专一性重组方法，将嵌段共聚物合成所需的操纵子序列多拷贝的整合到重组菌株的基因组上。通过检测，整合拷贝数为1-9个不等。由此我们成功构建了嵌段共聚物生产的底盘生物。通过发酵检测，当表达另一关键酶ilvACG时，该基础菌株能够在细胞内积累3HV含量较高的PHBV;当不表达ilvACG时，该基础菌株能够积累PHB。这为嵌段共聚物的生产打下了基础。
　　本研究的第二部分是利用基因回路生产嵌段共聚物的初步研究。在构建好基础菌株后，我们利用合成生物学方法，设计了用于控制基因表达的基因回路。我们将来自于费氏弧菌的群体感应系统luxRI和苏云金芽孢杆菌的高丝氨酸内酯酶基因aiiA，构建成基因回路，来周期振荡地调控嵌段共聚物生产中的关键基因ilvACG。实验初期我们以sfGFP作为报告基因，对构建的基因回路进行了调整和修饰，研究了组成型启动子、luxR的表达模式、蛋白降解速率以及信号分子传递效率对基因回路振荡情况的影响，并最终在摇瓶中初步检测到荧光的振荡。虽然我们还没有实现嵌段共聚物的生产，但是这些都为最终嵌段共聚物的生产奠定了基础。
　　本论文的工作，将微生物代谢调控和合成生物学结合在一起，将电子电路设计原理应用到生物系统中基因的表达调控中，为嵌段共聚物的生产提供了一种全新的方法和思路。