高产耐碱性漆酶菌株的获得及印染废水的漆酶生物脱色研究

摘要

漆酶(laccase)是一种含铜元素的多酚氧化酶(p-diphenoloxidase)，又称苯二醇氧化还原酶(EC1.10.3.2)。漆酶通过与空气中的氧气结合作用，能够催化包括单、双酚及多酚类、甲氧酚类、胺基酚类、芳香胺类、抗坏血酸和芳香硫醇类等多种酚类和非酚类化合物氧化，并生成相应的化合物与水，同时也被称为“绿色催化剂”。除去漆酶传统应用生漆干燥成膜外，漆酶在造纸工业、环境保护、有机合成、食品工业、染料降解、生物传感器等领域都有相关的应用。但是，当漆酶被用于上述工业中时，往往需要接触一些偏碱性的环境。而目前大多数的真菌漆酶在高pH下活力丧失严重，致使其应用受到诸多限制。选育新的漆酶产生菌，以生产出在较高pH值条件下仍具有较高酶活力的漆酶一直是研究的热点。
　　论文以前期实验室筛选到的一株产耐碱性漆酶真菌丛梗孢菌M5-3为出发株，以获得诱变高效菌株为目的，通过UV、ARTP两种诱变方法，结合变色圈与摇瓶产酶发酵的筛选方法，连续反复地诱变，获得了一株酶活相对较高的等离子体诱变突变株DM5-5，连续五次传代后酶活为3.33IU/mL。在研究丛孢梗菌原生质体的制备与再生条件的基础上，进一步对突变株DM5-5进行原生质体的ARTP-UV复合诱变，最终得到一株遗传性状相对稳定的高产耐碱性漆酶突变株ZMp1-17，酶活达到8.79IU/mL。另一方面，克隆得到了丛梗孢菌M5-3中的漆酶基因，成功构建了的pA81a-i、pA81a-ii草酸青霉M12表达载体，转化到表达宿主草酸青霉M12中。在宿主实现漆酶基因lac2的成功表达，为提高菌株产耐碱性漆酶的能力打下了基础。
　　对筛选得到的突变株所产的漆酶粗酶液对不同染料的生物脱色效果进行了探讨。表明丛梗孢菌DM5-5漆酶可以直接用于多种碱性染料脱色，且具有较好的脱色效果。影响脱色的各个因素都与漆酶本身和反应底物有直接关系，反应条件需要综合考虑。其中脱色温度40℃、反应体系pH值为7.5对多数底物而言都是最佳的处理条件。上述研究为促进耐碱性漆酶的生产和应用提供了参考。

目录

声明

摘要

符号说明及缩略词

第一章 前言

1．1 漆酶概述

1．1．1 漆酶及其来源

1．1．2 漆酶的结构与性质

1．1．3 漆酶的异源表达

1．2 漆酶的应用

1．2．1 漆酶在制浆造纸工业中的应用

1．2．2 环境保护

1．2．3 有机合成

1．2．4 漆酶在食品工业中的应用

1．2．5 生物传感器

1．2．6 染料降解

1．2．7 漆酶应用中的问题

1．3 微生物诱变育种技术

1．3．1 原生质体诱变技术

1．3．2 常压室温等离子体(ATRP)诱变

1．4 本文立题目的与思路

第二章 耐碱性漆酶高产突变株选育

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基及其制备方法

2．1．3 主要仪器与试剂常用储备液及缓冲液

2．1．4 菌株活化

2．1．5 菌丝体预处理

2．1．6 原生质体制备与再生

2．1．7 紫外线诱变(UV)

2．1．8 ARTP诱变

2．1．9 诱变后菌株的初筛

2．1．10 诱变后菌株复筛

2．1．11 诱变菌株遗传稳定性实验

2．1．12 分析方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 丛梗孢菌M5-3的菌丝体诱变

2．2．2 菌丝体诱变菌株的遗传稳定性

2．2．3 原生质体诱变

2．2．4 原生质体诱变突变菌株遗传稳定性

2．3 小结

第三章 漆酶基因草酸青霉中异源表达

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株及质粒

3．1．2 培养基及其制备方法

3．1．3 主要仪器与试剂常用储备液及缓冲液

3．1．4 漆酶总RNA提取及cDNA合成

3．1．5 全序列lacⅠ和lacⅡ的获得

3．1．6 草酸青霉M12重组表达载体的构建

3．1．7 原生质体的制备与转化

3．1．8 外源蛋白在草酸青霉M12中的表达与检测

3．2 结果与讨论

3．2．1 漆酶总RNA提取

3．2．2 全序列lacⅠ和lacⅡ的获得

3．2．3 DH5α载体pTla-Ⅰ、pTla-Ⅱ的构建及验证

3．2．4 pA8la-ⅰ、pA8la-ⅱ的构建及验证

3．2．5 pA8la-ⅰ、pA8la-ⅱ的DH5α转化子获得

3．2．6 pA8la-ⅰ、pA8la-ⅱ的草酸青霉M12转化子的验证

3．2．7 外源蛋白在草酸青霉M12中的表达

3．3 小结

第四章 染料的漆酶生物脱色研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与培养基

4．1．2 主要仪器与试剂常用储备液及缓冲液

4．1．3 染料性质参数测定

4．1．4 漆酶酶液获得

4．1．5 脱色体系

4．1．6 脱色实验

4．1．7 分析方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 漆酶粗酶液中三种氧化酶活力分析

4．2．2 对不同染料的脱色效果

4．2．3 漆酶脱色条件优化

4．3 小结

全文总结与展望

参考文献

致谢