长枝木霉SMF2peptaibols合成酶和蛋白酶基因敲除体系的构建及其peptaibols在植物生长中的功能研究

摘要

木霉（Trichodermaspp.）是一种腐生型丝状真菌，广泛分布在土壤、植物根际和叶面。木霉是一种重要的生防因子，对多种植物病原真菌具有很强的抑制作用。其生防作用机制包括抗生作用、重寄生作用、竞争作用和诱导植物抗性等。Peptaibols等次级代谢产物和胞外酶类在木霉的抗生作用的过程中发挥着重要的作用。长枝木霉SMF2(T.longibrachiatumSMF2，SMF2)菌株是本实验室筛选到的具有较强生防活力的菌株，前期研究发现其能够产生多种细胞壁降解酶(cellwalldegradeenzymes，CWDEs)和peptaibols类抗菌物质-Trichokonins。Trichokonins的主要组分TrichokoninⅥ(TKⅥ)含有20个氨基酸残基。本实验室已建立了Trichokonins的固体发酵技术和简单高效的分离纯化技术。在此基础上对其生物学活性进行了系列研究，Trichikonins具有抗菌、抗病毒、诱导肿瘤细胞凋亡和诱导植物抗性等多种生物学活性。前期实验还发现，低浓度的TrichokoninⅥ能够促进植物根系的生长发育而高浓度处理则抑制根系生长，但其与植物的相互作用机制尚未研究，目前也缺乏peptaibols与植物相互作用机制的研究。
　　本研究在前期工作的基础上，根据SMF2的基因组的分析结果，找到该菌株基因组中含有2个长的非核糖体合成酶(Non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS)编码基因负责peptaibols的合成，分别命名为tpx1和tpx2，其分别含有20个module和12个module。本研究根据同源重组原理，选用潮霉素磷酸转移酶基因hph和乙酰胺酶基因amdS作为筛选标记，构建了peptaibols合成酶基因的敲除载体，通过PEG-CaCl2转化法，对tpx1，tpx2进行基因敲除，通过PCR筛选和Southern杂交验证，获得了SMF2tpx1和tpx2基因缺失的SMF2突变株。
　　Peptaibols合成酶缺失突变株发酵产物的HPLC分析证实含有20个module的peptaibols合成酶基因tpx1控制一系列含有20个氨基酸的peptaibols的合成，而含有12个module的peptaibols合成酶基因tpx2控制含有12个氨基酸残基的peptaibols的生物合成。表型分析发现，peptaibols合成酶的缺失对木霉菌落形态、菌丝的生长和孢子的形成等生物学特征没有显著的影响。
　　体外研究表明，木霉Trichokonins能够影响植物的生长发育，但是目前还缺乏SMF2与植物互相作用实验的证实。本研究采用番茄作为实验植物，进行盆栽实验，研究了SMF2野生型菌株及其peptaibols合成酶缺失突变株对植物生长发育的影响。实验结果表明:野生型SMF2能够促进番茄生长，提高番茄生物量，促进根系的发育，而peptaibols合成酶的缺失，尤其是tpx2的缺失，影响木霉菌株对植物生长的促进作用。因此peptaibols的产生是木霉促进植物生长的机制之一。研究还发现，野生型和突变株与对照相比，都具有一定的促生作用，这表明SMF2中的其他生物活性物质也可能在其促生作用中发挥着作用。
　　前期研究还发现丝氨酸蛋白酶SprT具有很好的抗菌、杀线虫活性，本研究根据同源重组原理，选用hph作为筛选标记，运用融合PCR技术构建了sprT基因敲除载体，通过基因敲除方法获得SMF2sprT缺失突变子。丝氨酸蛋白酶sprT缺失突变株表型分析表明sprT的缺失不影响SMF2菌丝的生长、菌落形态和孢子的形成。突变株固体发酵粗提液的蛋白酶酶活下降，但由于其他蛋白酶的存在，因此其抗生作用并不用因sprT基因的敲除而全部丧失。

目录

声明

缩略词

摘要

第一章 研究背景和立题依据

1．1 木霉-植物-植物病原微生物相互作用

1．1．1 木霉-植物病原微生物相互作用

1．1．2 木霉-植物的相互作用

1．1．3 木霉制剂在农业生产中的应用

1．2 非核糖体合成肽peptaibols的研究进展

1．2．1 Peptaibols的来源与结构特征

1．2．2 Peptaibols的生物学活性

1．2．3 Peptaibols的生物合成

1．3 木霉蛋白酶的研究及其在生物防治中的应用

1．3．1 木霉蛋白酶的研究

1．3．2 木霉产蛋白酶的抗真菌活性研究

1．3．3 木酶蛋白酶杀线虫活性的研究

1．4 立题依据

第二章 长枝木霉SMF2 peptaibols合成酶基因缺失突变株的构建

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 培养基和溶液

2．2．3 主要试剂和仪器

2．2．4 Peptaibols合成酶基因敲除同源重组载体构建

2．2．5 SMF2原生质体制备

2．2．6 SMF2原生质体转化与再生

2．2．7 转化子筛选

2．2．8 转化子的Southern杂交验证

2．2．9 转化子的稳定性检测

2．2．10 突变体表型分析

2．3 结果与分析

2．3．1 Peptaibols合成酶基因敲除同源重组载体的构建

2．3．2 SMF2原生质体制备

2．3．3 MM培养基中CsCl浓度选择(tpx2敲除)

2．3．4 转化子PCR筛选

2．3．5 转化子Southern杂交验证

2．3．6 突变株表型分析

2．4 讨论

第三章 Peptaibols在长枝木霉SMF2与植物互作中的作用

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 菌株和种子

3．2．2 不同浓度SMF2孢子对番茄幼苗生长的影响

3．2．3 木霉野生型及其peptaibols缺失突变株对番茄幼苗生长的影响

3．2．4 番茄幼苗生物学指标的检测

3．2．5 统计方法

3．3 结果和讨论

3．3．1 不同浓度孢子对番茄生长影响

3．3．2 SMF2及其peptaibols缺失突变株对番茄幼苗生长及根系发育的影响

3．4 讨论

第四章 长枝木霉SMF2丝氨酸蛋白酶sprT缺失突变株的构建

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 主要试剂和仪器设备

4．2．3 SMF2丝氨酸蛋白酶sprT基因敲除载体构建

4．2．4 SMF2原生质体制备和转化

4．2．5 SMF2转化子PCR筛选和纯化

4．2．6 SMF2转化子Southern印记验证

4．2．7 SMF2转化子sprT基因转录qPCR分析

4．2．8 SMF2野生型和突变子蛋白酶酶活检测

4．2．9 SMF2和sprT缺失突变子与土壤病原真菌拮抗作用

4．3 结果与分析

4．3．1 sprT基因敲除载体构建

4．3．2 转化子筛选

4．3．3 Southern Blotting验证转化子△sprT40-2

4．3．4 转化子△sprT40-2丝氨酸蛋白酶sprT表达分析

4．3．5 转化子△sprT40-2表型分析

4．4 讨论

全文总结与展望

参考文献

致谢