哈茨木霉聚酮合成酶基因功能鉴定及基因工程菌株的构建

摘要

目前，广泛使用化学农药造成了日益严重的农产品和生态环境污染，使用对环境安全的生物农药已成为植物病害防治的新途径。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是优良的植物病害防治真菌，能产生具有抑菌活性的聚酮化合物6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮（monocillinⅠ）。但在哈茨木霉中催化6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮合成的相关酶及编码相关酶基因目前暂无报道，因此鉴定哈茨木霉合成该化合物关键酶基因，为阐明真菌聚酮化合物合成代谢调控机制提供理论依据。此外，从分子水平改变合成6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮关键酶基因的表达量并获得新的基因工程菌株，对于提高该化合物的发酵产量以满足工业化生产需要及新型生物农药应用具有重要的理论与实践意义。
　　本文围绕着深入研究的6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮合成的分子机理及提高其产量的实际问题，分析pkst-1和pkst-2基因在6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮合成中的功能并优化其高产菌株的摇瓶发酵条件和培养基。本研究取得的结果如下。
　　利用Southern印迹杂交分析pkst-1基因RNAi沉默转化子菌株T2和pkst-2基因敲除转化子菌株稳定遗传。相对实时定量 PCR和LC/MS分析结果证明pkst-1和pkst-2基因是6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮合成途径中的关键功能基因，认为聚酮合成酶PKST-1负责合成此化合物的终产物，而PKST-2负责该化合物前体的合成。
　　Southern印迹杂交分析pkst-1和pkst-2基因过表达转化子菌株T3和T5继代培养的遗传稳定性。LC/MS分析表明转化子菌株T5发酵6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮产量比野生型菌株高13.22％，比转化子菌株T3高11.68%，产量差异显著（P<0.05），结果表明在菌体内过表达pkst-2基因能提高菌体合成6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮的产量，转化子菌株能作为发酵该化合物的工程菌株。
　　此外，当培养条件相同时，转化子菌株T5代谢产物对植物根腐病菌立枯丝核的抑制效率比野生型菌株高14.01%。然而转化子菌株T3产6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮的产量和对植物根腐病菌立枯丝核的抑菌率与野生型菌株相同（P>0.05）。上述结果表明在菌体内提高pkst-2基因的表达量，其菌体的抑菌能力增强，转化子菌株T5能作为有效抑制立枯丝核菌的生物防治菌株。
　　对pkst-2过表达菌株T5的主要生物学特性进行了研究。结果表明最适生长、产孢和发酵6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮的温度均为25℃~30℃；最适的培养基pH为偏酸性；光照对产孢具有明显的促进作用。速效碳源、有机速效氮源和无机氮源以及高浓度的磷酸二氢钾是菌丝生长和产孢的最适条件。而迟效碳源、有机迟效氮源及低浓度的磷酸二氢钾是发酵6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮的最适条件。实时相对定量PCR验证植物病原真菌能诱导pkst-1和pkst-2基因高效表达。平板拮抗实验显示，T5对植物病原真菌菌丝采用附着、缠绕、平行生长等方法抑制病原真菌生长，与文献中所述哈茨木霉T88菌拮抗病原菌方式一致。
　　利用统计学原理开发高产发酵培养基可以节省大量时间和耗材,结果有效可靠。通过单因子实验和中心组合设计原理确定发酵6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮的最佳温度、培养基起始pH值和接种量的回归方程，作出响应面图。得出三者的最佳组合为温度26℃，培养基起始pH为5.88，接种浓度1.81×106 spores/mL，获得最大产量18.14 mg/L。
　　利用正交试验和Plackett-Burman原理建立6H-噁丙烯并（e）（2）苯并噁环丁并镭杂癸英-6,12（7H）-二酮产量与麦芽糖、黄豆粉和磷酸二氢钾的回归方程，并作出响应面曲线图。得出三者的最佳组合为麦芽糖4.4267%，0.372%和0.04%。通过对回归模型的验证，获得最高产量21.94 mg/L，比优化前的野生型菌株发酵产量高44.73%。

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第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 国内外研究综述

1.3 本文的主要研究内容和技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 pkst-1基因的克隆及功能研究

3.1 pkst-1基因的克隆及分析

3.2 pkst-1基因的功能分析

3.3 本章小结

第4章 pkst-2基因功能鉴定及基因工程菌株的构建

4.1 pkst-2基因的克隆与分析

4.2 pkst-2基因的功能分析

4.3 本章小结

第5章 pkst基因转化子菌株的生物学特性研究

5.1 pkst基因转化子抑菌机理研究

5.2 哈茨木霉T5的表型分析

5.3 本章小结

第6章 哈茨木霉T5发酵条件优化

6.1 哈茨木霉T5产monocillinⅠ发酵参数优化研究

6.2 哈茨木霉T5发酵产monocillinⅠ培养基优化

6.3 本章小结

结论

参考文献

附图

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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致谢

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