肾癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)检测及临床意义的研究

摘要

背景与目的： 肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)约占成人恶性肿瘤的2％-3％，全球每年有超过20万例新发病例及超过10万例死亡病例。约1/3的RCC患者就诊前已出现转移，约1/3的局限性RCC患者术后复发。在我国，RCC在泌尿系统恶性肿瘤中排名第二，且发病率逐年上升，如何防治RCC的复发和转移成为目前肾癌治疗中面临的重要挑战。 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能。1869年，Ashworth在1例晚期肿瘤患者外周血中发现与肿瘤细胞类似的细胞，首次提出了循环肿瘤细胞(Circulating TumorCell，CTC)这一概念。循环肿瘤细胞(CTC)被定义为自恶性肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞，它具有肿瘤特异性抗原或基因特征，在外周血中检测循环肿瘤细胞(CTC)并进行分析研究，对明确转移过程、辅助诊断、监测疗效、指导个体化治疗、判断预后等方面具有重要的临床应用价值。 目前对于CTC的检测有50余种方法，归纳起来包括以免疫反应为基础的检测方法、荧光定量PCR方法及以细胞过滤为基础的检测方法。目前较成熟的方法是Veridex公司开发的Cellsearch技术，CellSearch技术是美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)唯一批准的用于检测CTC的方法。它是一种半自动技术，通过载有抗EpCAM抗体的铁磁流体富集CTC，随后CTC用CK和DAPI荧光抗体染色，其余血细胞用CD45对比染色，CK+/DAPI+/CD45-细胞使用自动荧光显微镜进行计数。 CTC的检测包括富集和鉴定两个步骤，富集方法包括基于特异性免疫识别原理以及基于细胞形态学差异的富集方法。以免疫识别为基础的检测方法的局限在于，仅可识别典型的表达上皮抗原的CTC，不能识别发生上皮细胞间质变(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的CTC以及循环肿瘤细胞团（Circulating Tumor Microemboli，CTM），有文献认为其漏检率可达50％。 膜滤过分离肿瘤细胞技术（Isolation by Size of Epithelial Tumor cells，ISET）是一种不依赖于相关抗原抗体反应而直接过滤外周血进行肿瘤细胞富集的技术，根据肿瘤细胞体积大于外周血中粒细胞，从而使肿瘤细胞从外周血中分离出来，它减小了肿瘤细胞的丢失且不会破坏肿瘤细胞的形态学特征，同时也在很大程度上提高了检测的敏感性。已有研究证明在乳腺癌和肺癌的检测中，ISET法富集效率高于免疫磁性富集法。 目前，对肾癌患者外周血CTC检测的相关研究较少被报道，本实验拟分别以CellSearch法及ISET法检测肾癌患者外周血CTC，并与各临床病理特征及以往研究结果对比，寻找针对肾癌外周血CTC检测的合理方法，并讨论肾癌患者外周血CTC检测的临床意义。 资料与方法： 1.研究对象 2013年7月至2014年7月山东省肿瘤医院收治的肾透明细胞癌患者82例，其中男性63例，女性19例，年龄33-72岁，平均63岁。根据病理分期，Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例;根据病理分级，1级患者8例，2级患者32例，3级患者27例，4级患者15例。2013年7月选取20名经影像学检查证实健康的山东省肿瘤医院医务人员作为健康志愿者。所有受试者均排除有放化疗史及其他抗肿瘤治疗史。本实验已经山东省肿瘤医院伦理委员会审批并出具书面审批书，开始实验前，所有受试者均已征得本人及家属的同意，并签署知情同意书。 2.方法 2.1 样本采集与处理于肾癌患者术前1天空腹采血，健康受试者空腹采血，均取肘正中静脉为穿刺点，采血量15ml，随机取7.5ml于CellSearch专用Cellsave储存管，样本寄送至上海鼎晶公司，96h内以Celltracks(@)AutoPrep(@)系统检测;随机取7.5ml于EDTA抗凝管(BD)，24h内在山东省肿瘤医院中心实验室以武汉友芝友公司CTC-Biopsy检测仪检测。 2.2 CellSearch法检测流程以强生公司Celltracks(@)AutoPrep(@)自动检测系统检测样本。结果分析（细胞判读）:分析仪分析后，点击Review图标，根据CTC免疫荧光染色特性，表达CK+DAPI+CD45-空白通道-的细胞为CTC，对扫描后结果进行判定。 2.3 CTC-Biopsy检测仪（ISET法）检测流程以武汉友芝友生物公司CTC-Biopsy异常细胞分离染色仪检测样本。根据Hofman VJ等报道的ISET法CTC判读标准:细胞核大小变异大（比率＞0.5）;细胞核大于24 u m;细胞核形状不规则;染色质染色存在三维层次;高核质比，只要同时符合以上至少4个特征，就可从形态学上认为是CTC。由细胞室病理医师判读结果。 3.资料整理登记CellSearch法及ISET法检测结果，登记受试者的临床病理特征，列表记录。 4.统计方法应用SPSS19.0统计学分析软件及Excel2003软件行统计学分析及图表制作，单因素分析采用四格表Fisher确切概率法、行列表Fisher确切概率法和Kendall相关分析法，P＜0.05认为有统计学意义，多因素分析用logistic回归分析法，P＜0.05认为有统计学意义。 结果： 1.CellSearch法及ISET法检测健康受试者外周血结果本次实验检测健康志愿者20例，CellSearch法及ISET法检测外周血均未发现CTC。 2.CellSerach法检测肾癌患者外周血CTC结果及与临床病理特征的比较 2.1 CellSerach法检测肾癌患者外周血CTC结果接受检测的82例肾透明细胞癌患者中，外周血CTC数目≥1的有18例，根据病理分期，Ⅰ期2例、Ⅱ期1例、Ⅲ期3例，Ⅳ期12例;根据病理分级，1级2例、2级8例、3级2例、4级6例;外周血CTC数目≥2的有11例，根据病理分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期1例、Ⅳ期8例;根据病理分级1级2例、2级5例、3级1例、4级3例。 82例肾癌患者中，病理切片发现微血管浸润的患者13例，其中6例CTC数目≥1，2例CTC数目≥2;肿瘤中有组织坏死的患者22例，其中6例CTC数目≥1，2例CTC数目≥2。伴肉瘤样变的患者9例，其中3例CTC数目≥1，1例CTC数目≥2;集合系统受累的患者7例，其中2例CTC数目≥1，0例CTC数目≥2。ECOG评分≥1的患者9例，其中4例CTC数目≥1，1例CTC数目≥2。血小板计数≥450×109/L的患者7例，其中6例CTC数目≥1，2例CTC数目≥2。血红蛋白低于正常值的患者18例，其中4例CTC数目≥1，1例CTC数目≥2。中性粒细胞与淋巴细胞比值≥3.6的患者16例，其中6例CTC数目≥1，1例CTC数目≥2。 2.2 CellSearch法CTC检测结果与肾癌患者临床病理特征的相关性研究单因素分析，以Fisher确切概率法及Kendall相关分析法为统计方法，得出结论，取cutoff值为1时，CTC结果与临床分期被低估、病理分期、微血管浸润及血小板≥450×109/L相关(P＜0.05);取cutoff值为2时，CTC结果与淋巴结转移及病理分期相关(P＜0.05)。多因素logistic回归分析，取cutoff值为1时，CTC结果与病理分期、淋巴结转移、病理分级、肿瘤中有组织坏死相关。取cutoff值为2时，CTC结果与病理分期、病理分级、肉瘤样改变、NLR≥3.6相关。 3.ISET法检测肾癌患者外周血CTC结果及与临床病理特征的比较 3.1 ISET法检测肾癌患者外周血CTC结果接受检测的82例肾透明细胞癌患者中，28例患者外周血CTC检测阳性，4例患者外周血CTM阳性。其中根据病理分期，Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例;根据病理分级，1级患者8例，2级患者32例，3级患者27例，4级患者15例。 82例肾癌患者中，病理切片发现微血管浸润的患者13例，其中9例CTC阳性，2例CTM阳性;肿瘤中发现组织坏死的患者22例，其中9例CTC阳性，1例CTM阳性;伴肉瘤样变的患者9例，其中3例CTC阳性，未发现CTM;集合系统受累的患者7例，其中1例CTC阳性，未发现CTM; ECOG评分≥1的患者9例，其中5例CTC阳性，未发现CTM;血小板计数≥450×109/L的患者7例，其中5例CTC阳性，1例CTM阳性;血红蛋白低于正常值的患者18例，其中6例CTC阳性，2例CTM阳性;中性粒细胞与淋巴细胞比值≥3.6的患者16例，其中9例CTC阳性，2例CTM阳性。 3.2 ISET法CTC检测结果与肾癌患者临床病理特征的相关性研究单因素分析，以Fisher确切概率法及Kendall相关分析法为统计方法，得出结论，ISET法检测CTC结果与淋巴结转移、病理分期、微血管浸润、血小板≥450×109/L及NLR≥3.6相关(P＜0.05);CTM结果只与病理分期相关(P＜0.05)。多因素logistic回归分析，CTC结果与病理分期、远处脏器转移、病理分级、肉瘤样变、血红蛋白低于正常值相关。CTM阳性病例数过少，以至于无法筛出有影响的变量。 结论： 1.CellSearch法检测肾癌患者外周血CTC可行，取cutoff值为1时，病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC检出率分别为5.9％(2/34)、7.1％(1/14)、23.1％(3/13)、57.1％(12/21);取cutoff值为2时，病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC检出率分别为2.9％(1/34)、7.1％(1/14)、7.7％(1/13)、38.1％(12/21); 2.CellSearch法检测肾癌外周血CTC敏感性为21.9％(18/82)，健康受试者未检出CTC，因此其特异性为100％; 3.根据单因素及多因素分析，CellSearch法检测肾癌患者外周血CTC结果与病理分期、淋巴结转移、病理分级、肿瘤中有组织坏死、肉瘤样改变、中性粒细胞计数/淋巴细胞计数≥3.6等多个临床病理因素相关，推测CellSearch法检测肾癌患者外周血CTC可用于提示肾癌预后; 4.ISET法检测肾癌患者外周血CTC可行，病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC检出率分别为5.9％(2/34)、28.6％(4/14)、76.9％(10/13)、57.1％(12/21);病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTM检出率分别为0(0/34)、0(0/14)、15.4％(2/13)、9.5％(2/21)。 5.ISET法检测肾癌患者外周血CTC敏感性为34.1％(28/82)，健康受试者未检出CTC，因此其特异性为100％。 6.根据单因素及多因素分析，ISET法检测肾癌患者外周血CTC结果与病理分期、远处脏器转移、病理分级、肉瘤样变、血红蛋白低于正常值等多个临床病理因素相关，推测ISET法检测肾癌患者外周血CTC可用于提示肾癌预后。

目录

声明

摘要

符号及中英文说明

前言

第一部分 CellSearch法检测肾癌患者外周血CTC及其临床意义的研究

研究对象

Cellsearch方法与测量

结果

第二部分 ISET法检测肾癌患者外周血CTC及其临床意义的研究

研究对象

ISET方法与测量

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

学位论文评阅及答辩情况表

Research on detection of CTC in peripheral circulation of patients with renal cell carcinoma by ISET

Research on detection of CTC in peripheral circulation of patients with renal cell carcinoma by CellSearch