Th1/Th2和Th17/Treg平衡失调与宫颈癌发生发展关系及术后CD4+淋巴细胞亚群的改变

摘要

T淋巴细胞是人体内免疫系统的重要组成部分。研究表明:两大CD4+T细胞亚群Th和Treg细胞亚群即Th1、Th2、Th17和Treg四类CD4+T细胞及其相关细胞因子以及Th1/Th2和Treg/Th17两个稳态平衡在机体抗肿瘤免疫、肿瘤免疫逃避和耐受机制、肿瘤免疫微环境以及机体免疫稳态中发挥重要作用，对恶性肿瘤的发生、发展及预后至关重要。 HPV感染是宫颈癌发病的主要致病因素，为何只有少数HPV感染者宫颈病变？在仅有HPV感染尚未对宫颈细胞造成进一步病变阶段机体内免疫状态如何？宫颈癌(UCC)或宫颈癌前病变(CIN)机体内有无发生免疫失衡？CIN和UCC行手术切除前后机体免疫状态有无变化？目前缺乏全面系统的研究，分析患者机体免疫内环境将对UCC发生发展和术后临床预后监测及免疫治疗提供新思路。为此我们设计以下实验。 第一部分、CD4+T细胞各亚群及其相关细胞因子在HPV感染者、CIN和UCC患者外周血中以及CIN和UCC病变组织中的比例变化及意义 目的:检测CD4+T细胞各亚群Th1、Th2、Th17及Treg细胞及其相关细胞因子在HPV感染者、CIN和UCC患者外周血中以及CIN和UCC病变组织中的比例变化及意义，分析它们之间的相互关系及与UCC发生发展的关系。 方法:选取38例UCC患者、61例CIN患者、20例HPV感染为阳性宫颈液基细胞学检查正常患者和20例健康志愿者为研究对象，流式细胞分析术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞在各组研究对象外周血中的表达情况，免疫组化方法检测各细胞在CIN和UCC组织中的表达，ELISA方法检测血清内CD4+T细胞因子，分析检测指标之间及与临床病理指标之间的关系，进一步探讨其与UCC发生发展的关系。 结果: 1.UCC、CIN及HPV组患者外周血中Th1、 Th2细胞的比例外周血中Th1和Th2细胞比例:健康对照组和HPV组比较均无明显统计学差异（P＞0.05）;在CIN组和UCC组较健康对照组和HPV组Th1细胞比例明显降低(P＜0.05)。Th2细胞比例明显升高(P＜0.05)。 2.UCC组不同临床特征患者外周血中Th1和Th2细胞的比例UCC组患者中，Ⅰ期和Ⅱ期Th1细胞比例无明显差异（P＞0.05），Th2细胞比例有明显差异(P＜0.05);在有无淋巴结转移组和有无脉管浸润组各自组间中Th1和Th2细胞比例有明显差异(P＜0.05); Th1细胞比例和肿瘤大小呈负相关，而Th2细胞比例和肿瘤大小呈正相关，(P＜0.05)，与肿瘤组织学类型、分化程度无显著相关（P＞0.05）。 3.CIN组中不同级别CIN患者外周血中Th1、Th2细胞的比例CINⅡ组与CINⅢ组外周血中Th1明显下降（P＜0.05），Th2细胞明显升高（P＜0.05）。超过CINⅠ时，外周血中Th1细胞随着CIN级别下降，Th2细胞随CIN级别上升。 4.UCC、CIN及HPV组患者外周血中Th17、Treg细胞的比例外周血中Th17细胞的比例:对照组和HPV组之间无差异(P＞0.05)，CIN组和UCC组较对照组和HPV组分别明显升高(P＜0.05)，UCC组较CIN组明显升高(P＜0.05)。外周血中Treg细胞的比例:对照组和HPV组之间有差异(P＜0.05)，CIN组和UCC组较对照组和HPV组分别明显升高(P＜0.05)，UCC组较CIN组明显升高(P＜0.05)。 5.UCC不同临床特征患者外周血中Th17、Treg细胞的比例UCC组患者Th17细胞比例:Ⅰ期和Ⅱ期之间有明显差异(P＜0.05)，有无淋巴结转移和有无脉管浸润组有明显差异(P＜0.05)。UCC组患者Treg细胞比例与宫颈癌临床分期、有无淋巴结转移和有无脉管浸润无明显相关（P＞0.05）。Th17细胞和Treg细胞比例均和肿瘤大小呈正相关。 6.各级别CIN患者外周血中Th17、Treg细胞的比例CIN组患者中，和对照组及HPV组比较，不同级别CIN患者外周血中Th17和Treg细胞比例，随着CIN级别升高均显著升高(P＜0.05)。 7.UCC、CIN及HPV组外周血中Th1/Th2、Th17/Treg比值的变化外周血中Th1/Th2和Th17/Treg比值，对照组和HPV组之间无差异(P＞0.05)，UCC组和CIN组较对照组和HPV组分别明显升高(P＜0.05)。 8.PV6000免疫组化方法，测定对照组、CIN组、UCC组患者组织中INF-γ、 IL-4、IL-17及Foxp3表达和对照组比较，代表Th1的IFN-γ表达阳性率下降，代表Th2的IL-4表达阳性率上升。IL-17和Foxp3只在UCC组表达明显增加。 9.ELISA方法检测对照组、HPV组、CIN组和UCC组中血清中的INF-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-βI的浓度对照组、HPV组、CIN组和UCC组中血清中的INF-γ、 IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-βI的浓度检测发现:血清中的INF-γ的水平在UCC组显著低于其他组(P＜0.05)，随着宫颈病变的发生和发展呈下降趋势;血清中的IL-4水平随着宫颈病变的发生和发展升高，组内比较IL-4、IL-10、IL-17、IL-23和TGF-βI表达水在UCC组显著高于其他组(P＜0.05)，随着宫颈病变的发生和发展呈上升趋势。 结论:1.UCC机体内存在着Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡，具体表现为:患者外周血中Th1细胞水平明显降低，Th2细胞比率上升，外周血中Th1/Th2比值与对照组比较比值明显下降(P＜0.05)，肿瘤组织局部Th1/Th2比值与对照组比较未见明显差异(p＞0.05)。Th17细胞、Treg细胞在UCC患者、CIN及HPV组患者外周血中的比例上调，并随着疾病进展逐步积聚。2.在CIN阶段也存在着Th1/Th2、Th17/Treg的平衡失调，并随着疾病进展，失衡加重。3.在HPV感染组，Th1/Th2、Th17/Treg虽有轻度变化，但无统计学差异。因此保持动态平衡4.UCC的发生发展与Th1/Th2和Th17/Treg的失衡密切相关，明确这两个动态平衡的关系和对机体的免疫调节机制，将对UCC的诊断、病情估计和免疫治疗具有重要临床价值和意义。 第二部分、CIN及UCC术后外周血Th1/Th2、Th17/Treg细胞变化及意义 目的:评估宫颈癌前病变和UCC患者手术前后机体细胞免疫功能状态的变化，分析CD4+T各淋巴细胞亚群及其相关细胞因子与UCC及CIN临床预后及转归的关系，为临床提供重要依据方法:选取第一部分研究中20例UCC（Ⅰ a2-Ⅱ a）患者、21例宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)患者做为研究对象，UCC患者均行广泛子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术并根据年龄决定是否保留卵巢，CIN患者均行宫颈锥形切除术，术后病理再次证实诊断。于术后1个月、6个月应用流式细胞仪技术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞在各组研究对象外周血中的表达情况，分析Th1/Th2、Th17/Treg失衡在手术后的转归以及与临床预后之间的关系。 结果: 1.临床资料分析:UCC组患者共纳入20例UCC患者，纳入人群组间年龄无差异统计学意义（P＞0.05）。术后有4例患者合并淋巴结转移或/脉管浸润，后期行同步放化疗，其余16例在术后1个月和6个月随访进入本实验设计流程。4例患者后期行同步放化疗术后6个月随访时单独分析。 2.UCC组、CIN组患者手术前外周血中Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例患者外周血中Th1细胞比例在CIN组和UCC组较对照组显著降低(P＜0.05)，Th2相对于Th1反向改变(P＜0.05)。患者外周血中Th17和Treg细胞比例CIN组和UCC组较对照组显著升高(P＜0.05)。 3.UCC组手术前、后及与健康对照组外周血中Th1、Th2细胞比例(％)变化，与健康对照组比较，患者外周血中Th1细胞比例UCC术后1个月组和术后6个月恢复至正常水平。患者外周血中Th2细胞比例UCC术后1个月Th2细胞比例仍然较高（P＜0.05），术后6个月组接近正常。 4.UCC组手术前、后及与健康对照组外周血中Th17、Treg细胞比例(％)变化患者外周血中术前Th17细胞比例:明显高于健康对照组水平（P＜0.05），术后6个月基本恢复正常(P＞0.05)，与术前比较，UCC术后1个月降低(P＜0.05)，术后6个月显著降低(P＜0.05);与UCC术后1个月比较，术后6个月Th17细胞比例明显减低(P＜0.05)。患者外周血中Treg细胞比例:与健康对照组（2.00±0.66％）比较，UCC术后1个月Th2细胞比例仍然较高（P＜0.05），术后6个月组接近正常（P＞0.05）。与术前（5.29±1.26％）比较，UCC术后1个月降低（P＜0.05），术后6个月显著降低（P＜0.05）;术后6个月组较术后1个月下降(P＜0.05)。 5.CIN组手术前、手术后及与健康对照组外周血中Th1、Th2细胞比例(％)变化患者外周血中Th1和Th2细胞比例:与健康对照组和术前比较，CIN术后1个月和术后6个月Th1细胞比例均恢复至正常水平。 6.CIN组手术前、手术后及与健康对照组外周血中Th17、Treg细胞比例(％)变化患者外周血中Th17和Treg细胞比例:与健康对照组和术前比较，CIN术后1个月和术后6个月恢复正常。 7.淋巴结转移和脉管浸润的3例和仅有脉管浸润而无淋巴结转移的1例共4例患者，术后3周后和同步放化疗结束4周后检测外周血Th1、Th2、Th17和Treg细胞水平4例UCC患者Th1和Th2细胞比例:术后3周后均低于正常水平（P＜0.05），Th1细胞比例较术前明显回升（P＜0.05），同步放化疗结束4周Th1细胞水平基本恢复正常，显著高于术前和术后3周后水平（P＜0.05）。较手术3周后显著改善（P＜0.05）。4例UCC术后放化疗患者Th17和Treg细胞比例:术后3周后较对照组仍未恢复(P＜0.05)，仍接近术前水平(P＞0.05);同步放化疗结束4周后较对照组基本恢复正常(P＞0.05)，较手术3周后显著改善(P＜0.05)。 结论:UCC及CIN行满意的手术治疗后均能去除肿瘤负荷，解除机体免疫抑制状态，逐渐恢复正常机体免疫状态。术后有淋巴结转移者，术后1个月仅能部分恢复，但至术后6个月仍可达到正常水平。提示机体CD4+T细胞Th1/Th2、Th17/Treg平衡和UCC及CIN的临床转归及预后有着重要作用。将有望为评价UCC和CIN疗效和预测转归开辟一条新途径。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 UCC及CIN术后外周血CD4+T各淋巴细胞亚群的变化

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 附图

参考文献

致谢

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