Cytophaga hutchinsonii基于FLP--FRT重组系统敲除方法的建立及Ⅸ型分泌系统相关基因的研究

摘要

能源、资源和环境问题是21世纪人类生存发展所面临的严峻挑战。生物质资源是固定化的太阳能，其中植物生物质是地球上足以支撑人类生存发展的大规模可再生资源。对于以木质纤维素为主要成分的植物生物质资源的开发得到了世界上很多国家的重视。木质纤维素的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，它们分别占植物干重的35-50％、20-35％和5-30％。纤维素作为木质纤维素的主要组分，因其结晶区的存在，难以被酶高效降解，成为纤维素生物转化的瓶颈。因此，提高结晶纤维素的降解效率是木质纤维素高效转化的一个关键。 Cytophaga hutchinsonii是拟杆菌门（Bacteroidetes）一种广泛分布的革兰氏阴性细菌，可以快速彻底地降解结晶纤维素，并且在固体表面表现出滑动能力。C.hutchinsonii对纤维素的利用需要与纤维素底物的直接接触，而且大多数纤维素酶活都是细胞偶联的。基因组分析显示其不编码任何含有纤维小体特征的锚定(dockerin)或粘附(cohesion)结构域。因此，C.hutchinsonii的纤维素降解不同于已知的好氧微生物游离纤维素酶机制和厌氧微生物采用的纤维小体机制，可能是全新且未知的降解机制。对C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制的研究，揭开其高效降解结晶纤维素的奥秘，有助于促进木质纤维素生物转化的发展。另外，在拟杆菌门细菌Porphyromonas gingivalis和Flavobacterium johnsoniae中新发现的Ⅸ型分泌系统(T9SS)与它们的致病性和滑动相关，对C.hutchinsonii中T9SS的研究有助于揭开其滑动之谜。 之前由于C.hutchinsonii遗传操作体系的不成熟，对其纤维素降解机制和滑动的研究进展十分缓慢;近年来C.hutchinsonii遗传操作技术的不断发展使得这两方面的研究有了一定的进展。本文首先尝试了对C.hutchinsonii遗传操作技术的改进，使得基因的敲除更加高效;同时利用该技术对C.hutchinsonii的多个基因包括T9SS相关基因进行了敲除并对其功能进行了初步探究。具体的研究内容和结果如下: 1.基于FLP-FRT重组系统和线性DNA转化的敲除方法的建立 现有的C.hutchinsonii遗传操作都依赖于质粒作为载体进行转化，我们尝试将线性DNA片段转入C.hutchinsonii中进行同源重组。构建了分别带有抗性基因ermF和cat的模板载体pSJHS和pSJHC，抗性基因两侧含有多克隆位点可以插入同源臂。在尝试不同同源臂大小和线性DNA浓度后，发现约1μg线性PCR产物（每个同源臂含有至少1.5 kb同源序列）转化到约109个电转感受态细胞可以得到转化子。 来源于Saccharomyces cerevisiae的FLP-FRT重组系统是最有效的遗传工具之一，可以广泛应用于多种细菌。由于拟杆菌门细菌转录表达元件与变形杆菌门明显不同，该重组系统还没有被报道用于拟杆菌门细菌。为了用FLP-FRT重组系统进行无标记敲除，我们又构建了一系列质粒，包括引入同向FRT位点的两个红霉素抗性模板质粒和两个头孢西丁抗性模板质粒，以及一个FLP重组酶表达辅助质粒。通过线性片段双交换将同向FRT位点整合到基因组目标基因位置进行基因替换，然后转化FLP重组酶辅助质粒，可以将抗性标记成功切除，并且辅助质粒可以通过无抗性培养消除。我们成功将FLP-FRT重组系统改造应用于C.hutchinsonii实现了无标记敲除。 应用此方法我们成功实现了未知功能基因CHU_1165的无标记敲除，发现该基因的缺失会导致纤维素降解能力的缺陷，荠旦在软、硬琼脂上的扩散能力和玻璃表面的个体滑动能力都丧失。回补实验也证实所出现的表型缺陷均是CHU_1165敲除造成的，说明CHU_1165对C.hutchinsonii纤维素降解和运动具有非常重要的作用。生物信息学比对分析发现该基因可能编码了一个巯基二硫键氧化还原酶，其功能值得进一步研究。 2.FLP-FRT重组系统在C.hutchinsonii基因组大片段敲除中的应用 一直以来，C.hutchinsonii未知功能基因的鉴定主要依赖于转座子随机插入突变并通过表型筛选得到。然而转座子的插入并不是完全随机的，有一定的偏好性，构建突变子库并不能覆盖所有基因。C.hutchinsonii基因组中超过40％的基因未注释功能，用现有的遗传操作工具逐个鉴定它们需要大量的时间和精力。通过上文开发的无标记敲除方法，成功在C.hutchinsonii中实现了基因组大片段定点敲除。共获得了四个大片段敲除突变株，敲除的片段大小从9kb到19kb不等，覆盖基因数量从6个到22个，而这个过程仅需三或四次转化。这个方法可以使未知功能基因的鉴定更加快速高效，并且对条件必需基因的鉴定很有帮助。 其中一个基因组大片段CHU3190-3202含有四个分别注释为gspD，E，G和F的基因，可能与Ⅱ型分泌途径(T2SS)相关。这是C.hutchinsonii中除T9SS外仅有的被注释为已知跨外膜分泌系统的同源基因。这个可能的T2SS操纵子的敲除并没有导致C.hutchinsonii生长、纤维素降解和运动出现任何缺陷，说明它们不是C.hutchinsonii纤维素利用和运动所必需的基因。 3.C.hutchinsonii中Ⅸ型分泌系统相关基因的初步研究 最近的研究发现一些外膜蛋白在C.hutchinsonii纤维素降解过程中起重要作用，并且从外膜中分离鉴定出了内切纤维素酶。因此跨外膜的蛋白分泌系统可能在纤维素降解过程中起重要作用。C.hutchinsonii中有拟杆菌门细菌特有的T9SS的全套同源基因。T9SS与C.hutchinsonii纤维素降解和滑动的关系亟待阐明。通过开发的线性DNA双交换和FLP-FRT无标记敲除方法，对C.hutchinsonii多个T9SS相关基因进行了敲除，鉴定出了两个与纤维素降解和运动密切相关的基因 CHU_3237和CHU_0170。 CHU_3237预测是P.gingivalis T9SS中C端信号肽酶在C.hutchinsonii中的同源基因，它的敲除会导致菌体对滤纸纤维素的降解、琼脂表面的扩散运动以及玻璃表面的滑动能力均出现一定缺陷，不过不影响菌体在纤维素纤维上的排列。进一步对突变株和野生型的胞外蛋白进行分析，发现突变株培养液上清中缺失了几十种蛋白，其中许多是T9SS推测的底物蛋白。对胞外一个主要的蛋白同时也是T9SS底物的CHU_0344进行Western blot分析，证实了CHU_3237在C.hutchinsonii中也起到剪切CTD的肽酶的作用。 未知功能的CHU0170的敲除会导致纤维素尤其是结晶纤维素的利用缺陷，而且突变株在软琼脂中的扩散和个体在玻璃表面的滑动都出现一定的缺陷，不过并不影响菌落在硬琼脂表面的扩散能力。CHU_0170经预测可能是一个膜蛋白，它的缺失对外膜蛋白和胞外蛋白的影响主要体现在与野生型蛋白丰度的差异，具体的功能还有待深入研究。 另外，还鉴定出C.hutchinsonii中与T9SS相关的两个基因CHU_2610和 CHU_2225为冗余或半冗余基因，它们的敲除不会对C.hutchinsonii纤维素降解产生影响。CHU_0029为sprA同源基因，不完全敲除会导致C.hutchinsonii生活力严重下降。其他的T9SS核心组分同样不能被敲除，暗示T9SS对C.hutchinsonii的作用除纤维素利用、运动和蛋白分泌外，还可能有与其在F.johnsoniae和P.gingivalis中不同的某些未知的关键作用。 我们的工作证实了C.hutchinsonii中存在T9SS，并且T9SS在纤维素降解、运动和蛋白分泌方面都起重要作用，同时发现T9SS中关键组分可能是C.hutchinsonii的条件必需基因。T9SS如何影响了C.hutchinsonii的纤维素降解和运动将会是下一步研究的重点，其上百个可能的蛋白底物对这些过程的影响也需要逐一鉴定。 CHU_0834-0841基因组片段编码的六个蛋白序列一致性较高，并且除CHU_0839外其他均为T9SS推测的底物蛋白。鉴于已发现T9SS对于C.hutchinsonii的纤维素利用和滑动起重要作用，因此对其底物蛋白的研究具有重要意义。通过对CHU_0834-0841大片段的敲除以及表型实验分析显示，这几个T9SS的底物对于纤维素利用和菌体运动不是必需的。其他的T9SS底物蛋白还需进一步研究。 4.纤维素诱导条件下转录组分析和部分差异表达基因的研究 通过高通量测序技术RNA-seq对C.hutchinsonii在结晶纤维素诱导条件下的转录组与葡萄糖条件下转录组进行对比分析，发现了上千个差异表达基因以及可能的新转录本信息。从内切葡聚糖酶方面来看，CHU_1107和CHU_2103、CHU_1280和CHU_1655分别催化结构域一致性较高，并且CHU_1107、CHU_1655在C端都含有一个T9SS底物特有的CTD，暗示这四个内切酶可以分为两组。从转录组结果分析，CHU_1280和CHU_2103本底表达量较高，而CHU_1107和CHU_1655对纤维素诱导的响应更明显，显示了C.hutchinsonii精巧的纤维素酶表达调控机制。然而由于C.hutchinsonii基因组中未知功能的基因超过40％，因此大多数差异表达基因没有注释，无法通过聚类和KEGG pathway富集到某一注释的途径，这为转录组分析带来了很大的困难。 选择部分差异表达基因进行敲除并研究其与纤维素降解的关系。对十几个双组分调控系统基因进行敲除和表型分析，并没有发现对滤纸纤维素利用出现明显缺陷的突变株;对一些纤维素诱导表达差异明显的纤维素酶和未知功能蛋白的敲除，也没有导致C.hutchinsonii纤维素利用方面出现缺陷。推测由于C.hutchinsonii纤维素降解体系组成的复杂性和调控的精巧性，起关键作用的基因很少，因此对C.hutchinsonii基因表达调控、尤其是纤维素降解相关的关键基因的鉴定和调控研究仍需更多的时间和努力。 本文开发的基于线性DNA转化和FLP-FRT重组系统的无标记敲除方法可以成功用于C.hutchinsonii单基因和基因组大片段的敲除，使得遗传操作技术更加成熟高效，对于快速鉴定基因组中未知功能基因和基因簇很有帮助，为早日阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制和滑动机制提供了有力的技术保障。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 研究背景

1．1 纤维素资源的开发利用

1．2 纤维素的结构

1．3 纤维素的微生物降解

1．3．1 纤维素降解微生物

1．3．2 纤维素降解策略

1．4 滑动

1．4．1 Myxococcus xanthus

1．4．2 Flarobacterium johnsoniae

1．5 Ⅸ型分泌系统

1．6 Cytophaga hutchinsonii研究背景

1．6．1 Cytophaga hutchinsonii的系统发育和特征

1．6．2 C．hutchinsonii的研究进展

1．7 论文的立题和工作思路

第二章 C．hutchinsonii基于FLP-FRT重组系统和线性DNA转化的敲除方法的建立和应用

2．1 材料和方法

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基和缓冲液

2．1．3 试剂与仪器

2．1．4 实验中用到的质粒与引物

2．1．5 分子生物学常用反应体系及操作

2．1．6 E．coil感受态制备及热激转化

2．1．7 C．hutchinsonii感受态的制备及电击转化

2．1．8 C．hutchinsonii生长曲线测定

2．1．9 C．hutchinsonii纤维素降解分析

2．1．10 C．hutchinsonii菌落在PY2软、硬琼脂表面的扩散

2．1．11 玻璃表面菌体滑动的观察

2．2 实验结果

2．2．1 基于FLP-FRT重组系统和线性DNA转化的敲除方法的建立

2．2．2 基于FLP-FRT重组系统和线性DNA转化的敲除实例

2．2．3 通过线性DNA双交换整合到基因组的基因回补

2．2．4 Δ1165突变株表型研究

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 FLP-FRT重组系统在C．hutchinsonii基因组大片段敲除中的应用

3．1 材料和方法

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基和缓冲液

3．1．3 试剂与仪器

3．1．4 实验中用到的质粒与引物

3．1．5 分子生物学常用反应体系及操作

3．1．6 E．coli感受态制备及热激转化

3．1．7 C．hutchinsonii感受态的制备及电击转化

3．1．8 C．hutchinsonii纤维素降解分析

3．1．9 C．hutchinsonii菌落在PY2软、硬琼脂表面的扩散

3．1．10 玻璃表面菌体滑动的观察

3．1．11 C．hutchinsonii菌体在滤纸纤维上排列的扫描电镜观察

3．2 实验结果

3．2．1 FLP-FRT重组系统对C．hutchinsonii基因组大片段的敲除

3．2．2 大片段敲除突变株的表型研究

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 C．hutchinsonii Ⅸ型分泌系统(T9SS)相关基因的初步研究

4．1 材料和方法

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基和缓冲液

4．1．3 试剂与仪器

4．1．4 实验中用到的质粒与引物

4．1．5 分子生物学常用反应体系及操作

4．1．6 E．coil感受态制备及热激转化

4．1．7 C．hutchinsonii感受态的制备及电击转化

4．1．8 C．hutchinsonii生长曲线测定

4．1．9 C．hutchinsonii纤维素降解分析

4．1．10 C．hutchinsonii菌落在PY2软、硬琼脂表面的扩散

4．1．11 玻璃表面菌体滑动的观察

4．1．12 C．hutchinsonii菌体在滤纸纤维上排列的扫描电镜观察

4．1．13 纤维素酶活测定

4．1．14 蛋白浓度测定(Bradford法)

4．1．15 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

4．1．16 Western blot

4．1．17 C．hutchinsonii胞外蛋白、外膜蛋白的提取及质谱鉴定

4．1．18 再生无定形纤维素(RAC)的制备

4．2 实验结果

4．2．1 DHU_3237(porU)的功能研究

4．2．2 CHU_0170(porP)的初步研究

4．2．3 其他T9SS相关基因的初步研究

4．3 讨论

4．3．1 CHU_3237(porU)

4．3．2 CHU_0170(porP)

4．3．3 其他T9SS相关基因

4．4 小结

第五章 C．hutchinsonii纤维素诱导条件下转录组分析和部分差异表达基因的敲除

5．1 材料和方法

5．1．1 菌种

5．1．2 培养基和缓冲液

5．1．3 试剂与仪器

5．1．4 细菌总RNA的提取

5．1．5 RNA-seq实验流程和数据分析

5．1．6 实验中用到的引物

5．1．7 分子生物学常用反应体系及操作

5．1．8 E．coli感受态制备及热激转化

5．1．9 C．hutchinsonii感受态的制备及电击转化

5．1．10 C．hutchinsonii纤维素降解分析

5．1．11 C．hutchinsonii菌落在PY2软、硬琼脂表面的扩散

5．2 实验结果

5．2．1 C．hutchinsonii结晶纤维素诱导下转录组分析

5．2．2 部分差异表达基因的敲除及初步表型研究

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结及展望

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢