自噬在天然小分子化合物促进前列腺癌细胞死亡中的作用及其机制研究

摘要

天然材料作为药物的重要来源，是人类防治疾病的主要策略之一。近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已成为威胁人类健康的重要因素。其中前列腺癌(prostate cancer, PCa)是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤，是仅次于肺癌的第二大男性致死癌症。虽然我国前列腺癌的发病率明显低于西方国家，但随着老龄人口的增多、工业化环境污染的加重和饮食生活习惯的改变以及前列腺特异抗原筛查的逐步推广，其发病率呈逐年增加趋势。目前内分泌治疗是治疗早期前列腺癌的标准手段之一，然而大多数患者经内分泌治疗1-2年后易发展为激素难治性前列腺癌（Hormone Refractory Prostate Cancer，HRPC），表现出对雄激素撤除不敏感，恶性程度高，目前临床尚无理想的治疗方法。由于恶性肿瘤发病机制复杂，临床上肿瘤耐药时有发生，故单一的治疗方案或针对于某一细胞信号途径的化疗药物很难取得令人满意的效果。从天然资源中寻求高效低毒且具有多机制抑癌活性的新型天然抗肿瘤药物为癌症治疗提供了新思路。自然界数以百万计的植物、动物、微生物和海洋生物是新药研发的重要来源，从特殊生物资源中发现先导化合物已是目前国际药物研究的主流方向。
　　第一部分天然化合物抗肿瘤活性与诱导自噬活性筛选
　　前列腺癌易发展为雄激素非依赖性HRPC，化疗仍是治疗HRPC的主要手段之一，但目前所用化疗药物的临床治疗效果和预后均不理想。近年来，多种植物来源的天然小分子化合物由于其广泛而独特的生物学活性而备受关注，特别是其潜在的抗肿瘤活性更是现下研发热点之一。在本研究中通过对28种天然小分子化合物进行了抗肿瘤和诱导自噬活性筛选，并初步研究和分析了纯化于地衣的新型五环三萜酸Retigeric acid B(RB)和纯化于黑曲霉菌的环肽类Malformin A1(MA1)对前列腺癌细胞生物学活性的影响，取得了以下研究结果:
　　一、天然化合物抗肿瘤活性和诱导自噬活性筛选
　　通过对28种天然化合物的抗肿瘤活性和诱导自噬活性筛选，首次确定五环三萜类化合物RB和环肽类化合物MA1同时对前列腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用和不同程度的诱导自噬活性。
　　体外抗肿瘤活性筛选显示，前列腺癌细胞对RB敏感性最高，激素依赖型LNCaP细胞的IC50为7.97μM;非依赖型PC3和DU145的IC50稍高，约10μM;相比癌细胞，RB对正常前列腺上皮细胞的抑制活性弱;MA1显著抑制前列腺癌细胞PC3和LNCaP的增殖，IC50分别为130nM和90nM;而对前列腺正常上皮细胞RWPE1抑制作用稍弱，IC50高于200nM。
　　通过稳定表达GFP-LC3B的U87细胞中绿色荧光点状斑点的分布和数量为指标进行的自噬活性筛选结果显示，12种天然倍半萜类均对自噬的诱导效果微弱，12种天然三萜类中仅RB表现出中等程度的自噬诱导作用，其他影响不大;而同来源于地钱内生真菌黑曲霉的四种化合物中，MA1对自噬的诱导作用强;而其他3种化合物基本无影响。
　　二、RB抑制前列腺癌细胞侵袭转移、诱导细胞周期阻滞和凋亡
　　1.Transwell实验显示，经RB处理的激素非依赖性前列腺癌PC3和DU145细胞穿透matrigel胶的能力呈现浓度依赖性降低，表明肿瘤细胞侵袭转移能力的减弱。
　　2.RB诱导PC3细胞发生S期细胞周期阻滞、抑制DNA合成，并RB诱导凋亡。流式细胞术分析表明RB浓度依赖性诱导PC3细胞发生S期阻滞;RB通过调控PC3细胞中的周期相关调节因子，包括细胞周期蛋白cyclinA、cyclin E、cyclinB的表达和成视网膜细胞瘤抑制蛋白Rb的磷酸化水平，对其周期施加影响。BrdU掺入实验表明RB抑制DNA合成，并下调增殖细胞核抗原PCNA的表达水平;DAPI染色显示RB诱导PC3细胞发生凋亡的形态学特征;RB浓度依赖性下调Bcl-2表达水平，Bax随之累积，Bax/Bcl-2比例升高导致肿瘤细胞对RB诱导凋亡的敏感性;RB诱导caspases活化，促进PARP剪切，从而诱导凋亡。
　　4.RB抑制LNCaP细胞中AR的转录活性并诱导凋亡。RB浓度依赖性抑制AR的蛋白表达水平;RB浓度依赖性抑制AR目的基因雄激素应答基因PSA的启动子活性，并抑制PSA的分泌，说明RB抑制AR转录活性。RB浓度依赖性激活caspase-3，并促进PARP的剪切，从而诱导凋亡。
　　三、MA1诱导前列腺癌细胞凋亡和坏死
　　1.MA1诱导细胞凋亡。AnnexinV-FITC/PI双染表明，MA1显著诱导PC3和LNCaP细胞发生凋亡;western blotting结果显示，MA1激活caspase3，PARP发生剪切，并降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平;广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk部分阻断了MA1诱导的细胞死亡，说明其他类型的细胞死亡方式的存在。
　　2.MA1诱导细胞坏死。PI染色显示MA1处理PC3和LNCaP细胞后，时间依赖性引起细胞坏死，伴随LDH大量泄漏;同时定量PCR结果显示，MA1诱导炎症因子的过表达，引起炎症反应。
　　第二部分自噬影响Retigeric acid B和Malformin A1抗肿瘤活性的机制研究
　　自噬(autophagy)是由溶酶体所介导的细胞对自身的降解机制。其作用过程为:双层膜包裹细胞内的组分形成自噬泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，通过溶酶体中酸性水解酶将其所包裹的内容物消化和降解，从而实现细胞对于本身的代谢活动需要以及细胞器的更新。自噬的作用属于细胞应对营养缺乏、氧化应激、损伤应激、感染时的自我保护机制，但在强烈的应激条件下，过度的自噬可作为一种细胞死亡程序诱导细胞产生自噬性死亡。近来研究证明，自噬，包括线粒体自噬，在肿瘤细胞中可被化疗药物引起的不同形式的细胞应激所诱导。多种天然来源的抗肿瘤药物如紫杉醇和喜树碱能够诱导自噬，对肿瘤进展的控制和确定肿瘤细胞对化疗的反应具有重要性。基于第一部分的化合物筛选结果，我们对RB和MA1的诱导自噬的信号机制及其对前列腺癌细胞的抑制作用进行了探讨，取得了以下研究成果:
　　一、RB通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导保护性线粒体自噬
　　1.RB诱导前列腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B表达与LC3BⅡ的形成。基因芯片和定量PCR数据显示，RB诱导PC3和LNCaP细胞中自噬标志蛋白LC3B上调约2.5-3.5倍，而其它自噬相关基因表达变化程度较小或无影响;western boltting结果显示RB诱导中LC3B表达上调，并促进LC3BⅡ的生成;免疫荧光显示RB作用后，PC3细胞中出现点状LC3B聚集。
　　2.抑制自噬促进RB诱导的细胞死亡。采用siRNA技术和小分子抑制剂3-MA或氯喹抑制自噬过程，显著抑制细胞存活率，并促进RB诱导的PC3细胞死亡，说明RB诱导保护性自噬，延迟前列腺癌细胞死亡。
　　3.RB诱导线粒体损伤和ROS产生，并引起线粒体自噬。RB降低PC3和LNCaP细胞中线粒体膜电位，并呈时间依赖性，24h时膜电位均下降超过90％，导致线粒体严重损伤;通过流式细胞术显示，RB处理PC3和LNCaP细胞后，诱导ROS水平发生时间依赖性上升，24h时升高3倍以上;电镜观察发现RB处理PC3细胞后，线粒体过度肿胀，出现自噬泡和自噬溶酶体，且发现线粒体被自噬溶酶体包裹。
　　4.RB通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬。RB能够抑制Akt及下游作用蛋白mTOR的磷酸化水平，从而通过PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬。
　　二、MA1通过诱导氧化应激激活AMPK/mTOR信号通路而诱导致死性自噬
　　1.MA1诱导前列腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B表达与LC3BⅡ的形成。westernboltting与定量PCR结果显示MA1诱导LC3B表达上调，并促进LC3BⅡ的生成，而对其它自噬相关基因Atg5，Atg7和Beclin1表达无影响;免疫荧光显示RB作用后，PC3细胞中出现大量点状LC3B聚集。
　　2.采用小分子抑制剂3-MA抑制自噬，部分逆转MA1介导的细胞死亡，说明MA1诱导致死性自噬。
　　3.MAi通过AMPK/mTOR信号通路诱导自噬。MA1作用后，AMPK显著活化，进而其下游作用蛋白mTOR磷酸化水平被抑制，而mTOR途径的另一上游信号Akt无变化。
　　4.MA1通过诱导氧化应激激活AMPK/mTOR通路和自噬。MA1降低PC3和LNCaP细胞线粒体膜电位，呈时间依赖性，导致线粒体损伤;MA1诱导PC3和LNCaP细胞中ROS快速产生和ATP急剧消耗，并引起抗氧化蛋白SOD2，GSTP1和DJ-1过表达;采用小分子抗氧化剂VC和NAC能够部分逆转MA1介导的细胞增殖抑制;采用siRNA技术敲除SOD2后，LC3Ⅱ水平上调且促进细胞死亡，通过pEGFP-N1-SOD2质粒使SOD2过表达后，MA1诱导的LC3BⅡ水平发生下调且部分逆转细胞死亡，说明线粒体ROS累积和ATP消耗诱导的AMPK/mTOR信号通路参与MA1介导的自噬。
　　基于以上第一和第二部分的实验结果，由于MA1能够诱导坏死和炎症反应而具有较大的细胞毒性，因此我们在将在后续部分着重研究RB的抗肿瘤作用机制。
　　第三部分 Retigeric acid B通过阻断NF-κB信号通路抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭转移
　　NF-κB是前列腺癌多种发病因素下游的一个共同的关键环节，激活NF-κB信号引起肿瘤细胞的增值、浸润和转移。在经典NF-κB信号传导途径中，静息状态下，典型NF-κB二聚体(p50/p65)大部分与细胞质中的IκBα结合而以无活性的状态存在。各种信号通过降解IκBα的方式来活化NF-κB，IκBα的丝氨酸32、36位在IκBs激酶IKK的催化作用下发生磷酸化而被蛋白酶体泛素化降解，形成p50-p65二聚体，原先掩盖的核定位信号暴露，且p65亚基被磷酸化，促进核定位和转录活性，最终诱导目标基因的大量表达。
　　基于第一和第二部分研究发现RB对前列腺癌细胞具有抑制增殖和侵袭转移的能力，并显著抑制Akt信号，在本部分中，我们深入研究了RB对雄激素非依赖型PC3和DU145细胞中Akt下游NF-κB信号通路的影响及RB通过NF-κB发挥增殖和侵袭转移抑制活性的功能机制，并通过动物模型证明RB的体内抗肿瘤作用。
　　一、RB抑制肿瘤细胞p65磷酸化
　　1.RB抑制前列腺癌细胞PC3和DU145中p65磷酸化水平，并呈浓度和时间依赖性;RB对p65总蛋白和mRNA的表达影响较小。
　　2.RB对PC3和DU145细胞中p50与p52表达的无影响，说明RB对NF-κB的作用主要靶向经典通路。
　　3.RB抑制其他癌细胞的p65磷酸化水平，包括人肝癌细胞HepG2、人骨髓白血病细胞K562和其阿霉素耐药株K562/AO2，而对人卵巢癌症SKOV3和人肺腺癌A549细胞影响较小。
　　二.RB抑制前列腺癌细胞中NF-κB核定位与转录活性，同时阻断IκBα的降解
　　1.RB抑制p65核定位。Western blottiong和免疫荧光结果显示，RB浓度依赖性降低PC3细胞核中磷酸化p65的水平，而在未经RB处理的细胞中p65在细胞质和细胞核中均广泛存在。
　　2.EMSA结果显示RB浓度依赖性下调PC3细胞内NF-κB的DNA结合能力。
　　3.RB抑制NF-κB的转录活性。通过荧光素酶报告基因活性检测，RB抑制PC3和DU145细胞中持续活化的以及LNCaP细胞中脂多糖诱导的NF-κB转录活性。
　　3.RB抑制IκBα的磷酸化及其降解。Western blottiong显示RB处理导致PC3和DU145细胞中IκBα总蛋白过表达，IκBα磷酸化水平随之降低，呈浓度和时间依赖性;体外蛋白酶体活性测定显示，RB并未对重组20S蛋白酶体活性发挥抑制作用，说明RB可能通过抑制上游IKK激酶活性而抑制IκBα降解。
　　三、RB通过阻断NF-κB通路下调NF-κB目的基因的表达，抑制细胞增殖和侵袭转移
　　1.RB下调NF-κB目的基因的表达。Western blotting和定量PCR结果显示，RB浓度依赖性降低PC3和DU145细胞中bcl-xL、 bcl-2、survivin和cyclin D1的mRNA水平和蛋白质水平。
　　2.基因表达谱验证RB对NF-κB目的基因的影响，数据显示RB抑制PC3细胞中NF-κB信号调控的多种与细胞增殖和生存、侵袭转移相关的基因表达。
　　3.NF-κB通路参与RB的抗肿瘤作用。通过转染p65表达质粒提高PC3和DU145细胞中p65的表达和磷酸化水平后，RB诱导的细胞死亡被部分逆转且PARP剪切形式减少;利用siRNA技术敲低p65的表达，PC3和DU145细胞的存活率显著降低。
　　四、RB通过活化凋亡途径及抑制p65磷酸化发挥体内抑瘤作用
　　1.RB抑制体外鼠前列腺癌细胞RM-1增殖与p65磷酸化。
　　2.RB具有显著的体内抗肿瘤活性。构建C57BL/6鼠的RM-1同种移植肿瘤模型，RB处理组肿瘤体积和重量显著降低;肿瘤组织TUNEL染色结果显示，RB处理组的肿瘤组织中可见明显的染色阳性凋亡细胞;H&E染色则显示了肿瘤组织的形态学变化，表明RB能够提高肿瘤组织的细胞凋亡率。
　　3.RB影响肿瘤组织中NF-κB以及凋亡相关的蛋白表达。Westem blotting结果表明，RB诱导肿瘤组织中PARP剪切，抑制Bcl-2和Bcl-xL的表达，并上调Bax水平;Western blotting和免疫荧光结果显示，RB显著抑制p65磷酸化和核定位。
　　第四部分 Retigeric acid B通过靶向TopoisomeraseⅡα诱导DNA损伤促进前列腺癌细胞死亡
　　DNA拓扑异构酶(topoisomerases，Topo)普遍存在于细胞核，能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑状态。在多个对生命活动至关重要的生物学过程中，如DNA的复制、转录、重组、修复及染色体分离等，拓扑异构酶通过催化诱导瞬时的DNA单链断裂(SSBs)或双链断裂(DSBs)实现DNA局部拓扑结构的互变而发挥作用。多种化疗药物的抗肿瘤活性与其对酶-DNA可分裂复合物的稳定性相关，通过抑制拓扑异构酶-DNA共价化合物形成及诱导染色体和DNA损伤。ATF3(activating transcription factor3)属于ATF/CREB转录因子家族。ATF3是应激诱导基因，在正常细胞中其表达维持较低水平;当DNA损伤、氧化应激、内质网应激在内的多种应激信号作用于细胞时，ATF3可被迅速诱导表达，以维持细胞在应激条件下的基因组完整性和内稳态。然而，根据环境的不同，在持续或过强的应激状态下，ATF3可促进细胞凋亡。
　　基于第一和第二部分研究发现RB诱导细胞S期阻滞、抑制DNA合成，并通过线粒体损伤而促进ROS累积，均提示RB诱导DNA损伤，同时因其他五环三萜酸类已被证明具有TopoⅡ抑制活性，因此在这一部分中我们进一步分析RB诱导DNA损伤和直接靶向TopoⅡ的可能性，及DNA损伤应答信号在RB诱导的前列腺癌细胞死亡中发挥的重要作用。
　　一、RB诱导前列腺癌细胞DNA损伤并直接抑制TopoⅡα活性
　　1.RB诱导前列腺癌细胞DNA损伤。彗星实验结果证明RB显著诱导PC3和LNCaP细胞发生DNA损伤，呈时间依赖性。同时western blotting显示RB时间依赖性上调DNA损伤标志蛋白γH2AX水平，而H2AX总蛋白水平无明显变化。
　　2.RB抑制TopoⅡα活性。通过体外kinetoplast DNA解联检测，RB浓度依赖性抑制TopoⅡα活性;分子对接技术显示RB与TopoⅡα的潜在结合位点:RB的功能基团羧基中的羰基氧和羟基中的羟基氧分别与水分子与的赖氨酸798位通过疏水作用相结合;RB中的羧基与赖氨酸798位也有离子间的相互作用。
　　3.RB对拓扑异构酶家族基因表达水平的影响较弱。基因表达谱、定量PCR和western blotting分析表明RB作用可轻度抑制PC3细胞中TOP2A和TOP3A的mRNA和蛋白的表达。
　　二、RB通过活化ATM/ATR途径诱导DNA损伤应答信号
　　1.RB激活ATM/ATR信号网络。通过时相研究，RB作用早期激活ATM/ATR的效应蛋白p53、Chk1和Chk2，继而活化下游底物Cdc25A和Cdc25C，从而对细胞周期和生存发挥作用;特异性ATM抑制剂Ku55933阻断RB介导的γH2AX和phosphor-Chk2水平上调;由于细胞类型的不同，在PC3和LNCaP中，RB对ATM/ATR信号通路的调控方式具有时间差异。
　　2.ATM/ATR通路参与RB诱导的DNA损伤和细胞凋亡。在PC3和LNCaP细胞中，ATM/ATR的广谱抑制剂咖啡因处理后几乎完全阻断了RB诱导H2AX磷酸化水平及PARP的剪切;且RB诱导的细胞死亡被部分逆转。
　　三、RB抑制前列腺癌细胞DNA修复
　　1、RB下调DNA修复相关基因的表达水平。基因表达谱和qPCR结果显示多种与DNA损伤反应和DNA复制的基因在RB作用后下调且后期变化显著;westernblotting检测DNA修复相关蛋白的蛋白表达，BRCA1被早期激活，Rad51和Ku86则在后期下降约2倍，而Ku70的表达没有明显变化。
　　2、RB抑制DNA末端连接活性。通过体外DNA末端连接活性检测，RB处理显著抑制二聚体及多聚体的形成，表明RB能够显著抑制核蛋白中DNA修复酶类的催化活性。
　　四、RB诱导的DNA损伤效应与ATF3及其他应激反应基因变化有关
　　1.RB诱导细胞应激相关基因发生变化。基因表达谱显示RB作用对应激及DNA损伤相关基因表达的总体变化，定量PCR技术进一步验证，转录因子如ATF3、ATF4、ATF6及KLF6、EGR1、ETS1，应激反应基因PTGS2、促凋亡基因如DDIT3、DDIT4、GADD45A、DR5等发生显著变化;其中ATF3尤为显著，在PC3和LNCaP细胞中分别上调24.13和38.63倍;western blotting结果显示RB显著诱导ATF3的蛋白表达。
　　2.RB促进ATF3的转录活性。荧光素酶报告基因检测表明，RB显著降低PC3和LNCaP细胞中ATF3的启动子活性;从而增强ATF3的转录以促进表达。
　　3.LNCaP细胞中p53活化增强RB诱导的ATF3表达。转染突变型p53表达质粒于LNCaP细胞后，RB对ATF3表达的诱导作用显著减弱。
　　4.RB促进ATF3发生核定位。western blotting结果显示，RB促进PC3和LNCaP细胞中ATF3在细胞核中聚集，胞液中相对减少，呈时间依赖性，ATF3核定位有助于发挥转录因子活性。
　　五、ATF3通过活化凋亡相关基因促进RB介导的细胞死亡
　　1.抑制ATF3的表达逆转RB诱导的细胞死亡。利用siRNA技术抑制ATF3的表达，RB作用于PC3和LNCaP细胞后，存活率显著提高，凋亡细胞减少;ATF3敲除未改变H2AX的磷酸化水平，表明ATF3过表达不能导致DNA损伤;RB介导的ATF3过表达及核定位并不能被caspase抑制剂z-VAD-fmk所阻断，表明ATF3的诱导并不是caspase激活的下游事件。
　　2.抑制ATF3导致其下游促凋亡目的基因的表达变化。敲除ATF3后，与细胞死亡相关的重要调控因子DDIT4、GADD45A和DR5 mRNA水平显著下降，与细胞周期调控因子CDC25A明显上调，从而阻断RB介导的细胞增殖抑制与细胞死亡作用。
　　3.RB通过KLF6促进ATF3的表达。通过ATF3启动子荧光素酶报告基因检测，转录因子EGR1、 ETS1、 E2F1、 Sp1、STAT3、KLF6、 ETV1和ERG1中，而仅KLF6显著促进RB诱导的ATF3启动子活性，说明RB通过诱导KLF6促进ATF3的表达。
　　第五部分结论和创新点
　　一、结论:
　　1.通过对多种天然小分子化合物的抗肿瘤和自噬诱导活性筛选，确定五环三萜酸类化合物Retigeric acid B和环肽类化合物Malformin A1均具有显著的前列腺癌细胞抑制活性和诱导DNA损伤能力，且对自噬具有不同程度的诱导活性。
　　2.Retigeric acid B通过诱导线粒体损伤从而导致凋亡和线粒体自噬，后者对细胞具有保护性作用，延迟前列腺癌细胞死亡;Malformin A1通过诱导线粒体损伤、ROS累积和ATP急剧下降，激活AMPK/mTOR信号通路，从而诱发致死性自噬。
　　3.Retigeric acid B通过阻断NF-κB信号通路抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭转移，并具有体内抗肿瘤活性，显著抑制C57BL/6鼠中前列腺癌的发展。
　　4.Retigeric acid B通过靶向抑制拓扑异构酶Ⅱ诱导DNA损伤，激活ATM/ATR/Chk信号网络;作用后期抑制DNA修复并促进应激转录因子ATF3高表达与核定位，从而激活其下游促凋亡信号而促进前列腺癌细胞死亡。
　　二、创新点:
　　1.首次报道五环三萜酸类化合物Retigeric acid B的抗肿瘤活性，阐明Retigericacid B抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭转移、及诱导细胞死亡的多作用机制，并明确了Retigeric acid B对动物肿瘤模型的体内抑瘤活性。
　　2.首次报道Retigeric acid B的直接作用靶点拓扑异构酶Ⅱ，动态分析Retigericacid B诱导DNA损伤、抑制DNA修复和激活应激转录因子ATF3对细胞死亡的促进作用，阐明Retigeric acid B诱导细胞死亡的完整作用机制。
　　3.首次报道环肽类化合物Malformin A1的自噬诱导作用，并阐明其诱导自噬的信号机制。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 天然化合物抗肿瘤活性与诱导自噬活性筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 自噬影响Retigeric acid B和Malformin A1抗肿瘤活性的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 Retigeric acid B通过阻断NF-κB信号通路抑制前列腺癌细胞的增殖和转移

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 Retigeric acid B通过靶向Topoisomerase Ⅱα诱导DNA损伤促进前列腺癌细胞死亡

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

致谢

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