Anti-EGFR耦联中空金纳米球对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的研究

摘要

目的：探索抗表皮生长因子受体单克隆抗体耦联中空金纳米球(anti-EGFR/HGNs)增加宫颈癌细胞对HGNs的选择性摄取，并增强宫颈癌细胞的放射敏感性的可行性。
　　方法：采用免疫荧光染色进一步证实EGFR在人宫颈癌细胞株CaSki细胞表面高表达;通过电化学置换法制备HGNs;透射电子显微镜(TEM)观察HGNs的尺寸和形态;带双官能团的SH-PEG-COOH(分子量5000Da)作为anti-EGFR单克隆抗体与HGNs的连接介质，介导HGNs的表面修饰;分光光度计检测以证实抗体与HGNs成功连接;电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)测量金纳米粒子溶液的浓度，并分别检测细胞内HGNs及anti-EGFR/HGNs的摄取量;CCK-8法进行HGNs及anti-EGFR/HGNs的细胞毒性检测以及接受高能照射后的细胞存活率分析;AnnexinⅤ-FITC及PI双染法流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期;细胞经不同处理后提取蛋白， western-blot检测Bcl-2，Bax，Bad，active caspase3等凋亡相关蛋白的表达。
　　结果：免疫荧光染色证实EGFR在CaSki细胞表面高表达。TEM测得所合成HGNs平均直径(54.6±7.11 nm)，壁厚(5.01±2.23 nm)。分光光度计检测可见HGNs与anti-EGFR连接后表面等离子体共振峰(SPR)的特征性红移(≈20 nm)，证实anti-EGFR与HGNs成功连接。Anti-EGFR/HGNs与细胞共同孵育可致细胞内HGNs摄取量显著增加。HGNs及anti-EGFR/HGNs对CaSki细胞均无明显毒性。然而anti-EGFR/HGNs联合X线高能照射表现出显著细胞毒性。与对照组及X线单纯照射组相比，anti-EGFR/HGNs+X线照射组细胞凋亡率明显增加。Anti-EGFR/HGNs使处于G2/M期的宫颈癌细胞比率增加，并通过下调Bcl-2的表达及上调Bax，Bad，caspase-3的表达促进细胞凋亡。
　　结论：anti-EGFR/HGNs显著增加宫颈癌细胞对HGNs的摄取，并通过增强细胞凋亡，显著增加6 MV高能照射对CaSki细胞的毒性，具有放疗增敏作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

主要材料和设备

1．1 主要试剂

1．2 主要设备

1．3 主要试剂的配制

1．4 细胞株

实验方法与步骤

2．1 细胞培养

2．2 免疫荧光实验

2．3 HGNs的合成

2．4 HGNs的表面修饰

2．5 HGNs的细胞毒性检测

2．6 HGNs及anti-EGFR／HGNs的细胞内摄取

2．7 放射及细胞存活率检测

2．8 细胞凋亡分析

2．9 细胞周期检测

2．10 凋亡相关蛋白检测

2．11 统计学处理

实验结果

3．1 免疫荧光显色

3．2 HGNs的合成及特点

3．3 Anti-EGFR与HGNs相连接

3．4 细胞毒性

3．5 细胞内摄取量

3．6 对细胞放射敏感性的影响

3．7 细胞凋亡分析

3．8 细胞周期检测

3．9 细胞凋亡相关蛋白的表达

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文