CXCL16介导oX-LDL致阿霉素肾病小鼠足细胞损伤的机制及辛伐他汀干预研究

摘要

目的:
　　原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome，PNS)是儿童时期常见的肾小球疾病，其病理类型包括微小病变型、局灶节段性肾小球硬化、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病等，其发病机制主要是由多种原因导致的肾小球滤过屏障损伤引起，肾小球滤过屏障由内向外由以下三层组成:内层毛细血管的内皮细胞，中层肾小球基底膜，外层肾小球的上皮细胞，即足细胞。足细胞损伤是肾小球滤过屏障受损的重要原因之一，目前越来越多的研究逐渐认识到足细胞损伤是肾脏损伤的早期靶点，大量研究证实，足细胞与基底膜粘附功能减弱在肾病综合征的发生发展中发挥着至关重要的作用。足细胞通过许多粘附分子锚定于基底膜上，其中α3β1整合素最为重要。既往关于足细胞上α3β1整合素的研究主要集中于糖尿病肾病，肾病综合征中相关研究较为少见。CXC趋化因子配体16(chemokine ligand16，CXCL16)是2001年新发现的一种趋化因子，具有清道夫受体功能，最新研究发现CXCL16参与肾脏疾病的发生发展。
　　本课题组前期研究显示在阿霉素肾病发生发展中，足细胞上CXCL16可能与肾组织氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，ox-LDL)的沉积有关。但关于CXCL16如何引起肾组织足细胞ox-LDL沉积以及ox-LDL进入足细胞后如何引起足细胞损伤，导致肾小球滤过屏障受损，从而促进阿霉素肾病的发生发展，目前尚未见报道。
　　高脂血症是儿童PNS重要的病理生理表现之一，以血浆中总胆固醇(totalcholesterol，TC)和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）升高较为显著。临床上可采用降脂药物治疗，降脂药物一般选用以降胆固醇为主的羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，即他汀类药物，目前辛伐他汀应用较为广泛。他汀类药物不仅可以通过降低血浆TC水平发挥其肾脏保护作用，还可以通过非依赖降血脂途径起到保护肾脏作用，但确切机制尚不明确，其是否通过影响肾小球足细胞CXCL16表达来干扰ox-LDL的细胞内摄取，减少足细胞脂质蓄积，从而发挥其肾脏保护作用，目前国内外少见报道。
　　本研究拟通过建立阿霉素肾病小鼠模型，观察肾组织形态学、CXCL16、ox-LDL、NF-κB以及α3β1整合素等表达的变化，同时应用小剂量辛伐他汀干预治疗阿霉素肾病小鼠，观察上述指标的变化，旨在探讨肾病综合征中高脂血症引起肾脏足细胞损伤的具体机制，并进一步探讨阿霉素肾病中辛伐他汀不依赖其降脂作用而发挥肾脏保护作用的可能机制。
　　方法:
　　将15只雄性Balb/c小鼠随机分为正常对照组(NC组，n=5)、阿霉素肾病组（ADR组，n=5）以及辛伐他汀治疗组(ADR-SIM组，n=5)。应用阿霉素(ADR)诱导阿霉素肾病模型，造模成功后每天于固定时间给予对辛伐他汀治疗组小鼠辛伐他汀4mg/kg灌胃，其余2组均用等量生理盐水灌胃。7周后所有小鼠一次性处死，留取血液、24h尿液，摘取肾脏。考马斯亮蓝G-250(CBB)法测定24h尿蛋白定量，全自动生化分析仪检测血清胆固醇以及白蛋白水平，ELISA法检测血清ox-LDL、IFN-γ水平，双重免疫荧光法检测肾小球足细胞CXCL16、ox-LDL表达，免疫组织化学SABC法检测肾小球NF-κB表达，免疫荧光法检测肾小球α3β1整合素表达，western blotting法检测肾脏CXCL16和NF-κB表达，光镜、电镜观察肾组织组织学改变。
　　结果;
　　1.各组小鼠体质量、24h尿蛋白定量以及血清白蛋白、总胆固醇、ox-LDL的变化
　　与正常对照组相比，阿霉素肾病组、辛伐他汀治疗组小鼠体质量、血清白蛋白明显降低(P＜0.05)，而24h尿蛋白定量、血清TC以及ox-LDL水平明显升高（P＜0.05）。与阿霉素肾病组相比，辛伐他汀治疗组小鼠体质量、血清白蛋白明显升高(P＜0.05)，24h尿蛋白定量明显降低(P＜0.05），而血清TC和ox-LDL水平则无明显降低(P＞0.05)。（见图1）
　　2.各组小鼠肾组织形态学变化
　　光镜下，与正常对照组小鼠相比，阿霉素肾病组小鼠肾小球出现系膜细胞中重度增生、球囊粘连以及局灶节段硬化。肾小管管腔节段性扩张，血管管壁增厚，细胞核增多。辛伐他汀治疗后系膜增生、系膜基质增生明显减轻，肾小管扩张、血管管壁增厚减轻，但仍未完全恢复正常。与正常对照组相比，阿霉素肾病组与辛伐他汀治疗组肾脏慢性指数（Chronicity Index，CI）明显增加(P＜0.05)，但是应用辛伐他汀治疗后，CI明显降低(P＜0.05)。电镜下，正常对照组小鼠肾小球基底膜均匀一致，足细胞及足突形态正常。阿霉素肾病组小鼠肾小球系膜细胞及基质重度增生，基底膜弥漫增厚，足突广泛融合。辛伐他汀治疗后系膜增生、基底膜增厚以及足突融合明显减轻，但仍未完全恢复正常。（见图2，图3）
　　3.各组小鼠血清IFN-γ、肾组织NF-κB的变化
　　与正常对照组相比，阿霉素肾病组、辛伐他汀治疗组血清IFN-γ水平显著升高(P＜0.05)，肾组织NF-κB表达显著增加（P＜0.05）。与阿霉素肾病组相比，辛伐他汀治疗组小鼠组血清IFN-γ水平、肾组织NF-κB表达水平有不同程度的减少(P＜0.05)。（见图4）
　　4.各组小鼠肾小球足细胞CXCL16、ox-LDL表达的变化
　　与正常对照组相比，阿霉素肾病组、辛伐他汀治疗组小鼠肾小球CXCL16、ox-LDL表达增加（P均＜0.05）;与阿霉素肾病组相比，辛伐他汀治疗组CXCL16、ox-LDL表达水平有不同程度的下降（P均＜0.05），但仍未达到正常水平。进一步通过CXCL16、ox-LDL与Synaptopodin免疫荧光双标记，发现CXCL16主要在足细胞细胞膜上表达，ox-LDL主要在足细胞细胞膜以及细胞浆中表达。（见图5，图6）
　　5.各组小鼠肾小球α3β1整合素表达水平的变化
　　与正常对照组相比，阿霉素肾病组、辛伐他汀治疗组小鼠肾小球α3β1整合素表达水平下降(P＜0.05);与阿霉素肾病组相比，辛伐他汀治疗组α3β1整合素表达水平上升(P＜0.05)，但仍未达到正常水平。（见图7）
　　结论
　　1.在阿霉素肾病发生发展过程中，CXCL16可作为足细胞摄取ox-LDL的清道夫受体，协助足细胞摄取ox-LDL，从而引起足细胞脂质蓄积，导致足细胞损伤
　　2.足细胞上CXCL16介导ox-LDL进入足细胞后，可能一方面通过激活NF-κB信号传导通路，激活肾脏局部炎症反应，加强炎症因子介导的肾脏免疫损伤，进而促进肾病的发生发展;另一方面可能通过降低足细胞α3β1整合素表达水平，减弱足细胞与基底膜的黏附，进一步减少肾小球足细胞数量，进一步促进肾小球硬化的进展。
　　3.辛伐他汀可以不依赖其降血脂作用发挥对肾脏保护作用。
　　4.辛伐他汀的肾脏保护作用可能通过减少肾小球足细胞CXCL16的表达，进而减少足细胞对ox-LDL的摄取，减轻足细胞脂质沉积。脂质沉积减轻后一方面可能通过抑制NF-κB信号通路激活，减轻肾脏局部炎症反应，减轻炎症因子介导的免疫损伤，进而发挥肾脏保护作用;另一方面可能通过增加足细胞α3β1整合素表达，加强足细胞与基底膜的黏附，进一步增加肾小球足细胞数量，进而发挥肾脏保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

研究对象和方法

一．实验材料

二．实验方法

三．统计学分析

实验结果

1．各组小鼠体质量、24h尿蛋白定量以及血清白蛋白、总胆固醇、ox-LDL的变化

2．各组小鼠肾组织形态学变化

3．各组小鼠血清IFN-γ、肾组织NF-κB的变化

4．各组小鼠肾小球足细胞CXCL16、ox-LDL表达的变化

5．各组小鼠肾小球α3β1整合素表达水平的变化

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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