MicroRNA-203靶向ZNF217基因调控结直肠癌生物学行为的研究

摘要

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率分别占男性和女性全部恶性肿瘤的9.4％和10.1％，每年约有120万名患者被诊断为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。在西方发达国家，其发病率高居肿瘤第二位，死亡率高达33％。随着我国经济水平和生活水平的持续提高，饮食习惯与结构的改变，国内结直肠癌的发病率表现出明显的增长趋势，全国每年约有新发病例13万，近几年国内结直肠癌发病率正以4％的速度递增，已经跃居我国恶性肿瘤死亡率第五位。东南沿海地带成为结、直肠癌高发区域，发病率约为48/10万，与西方发达国家类似，我国结直肠癌发病具有年轻化、家族聚集、遗传易感等特征。现阶段结直肠癌的治疗主要靠手术，但由于大部分肿瘤发现已经是晚期，而且术后易发生复发、辅助治疗疗效不理想，都会影响病人的生存情况与治愈效果，因此，对结直肠癌的发生发展机制需要进行进一步更深入的研究，以便探索更为有效的治疗途径。
　　结直肠癌与其他类型肿瘤一样，其发生发展是一个多步骤、多水平、多基因参与的过程，伴随着复杂的基因表达失调，其中包括编码及非编码基因的结构和表达的异常。结直肠癌发生的分子机制尚未阐明，早干预、早发现和早治疗是改善结直肠癌患者预后、提高患者治愈率的关键，深入研究结直肠癌相关基因的异常表达机制将有助于结直肠癌的预防、诊断、和治疗。
　　锌指蛋白(ZNF)217基因定位在20q13.2，是一种锌指蛋白，编码为Kruppel样的转录因子。ZNF217做为一种转录抑制因子，可以和CTBP1/2与组蛋白修饰酶结合相联形成复合物，由其锌指结构介导，然后和启动子结合，对和细胞分化和器官形成有关的转录因子发挥抑制作用，ZNF217基因作为转录调控因子有可能参与肿瘤的发生与发展过程，到目前为止，一些研究结果证实ZNF217在乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中表达上升，而且在乳腺癌和卵巢癌中已经证实ZNF217与肿瘤的发生及发展密切相关，在结直肠癌中，ZNF217表达水平增高，但与病人的病理特点、病人的预后之间的相关性，目前少有报道，同时阐明ZNF217通过什么途径促进肿瘤的发生发展，可为肿瘤的靶向治疗提供新的位点，具有极其重要的意义，这进一步促使我们研究ZNF217在结直肠肿瘤环境中参与肿瘤发生发展的分子机制。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内生的，长度约16-24个核苷酸的小RNA分子，是当前处在研究热点的非编码RNA，它能够与mRNA的种子序列配对结合，从而抑制其靶基因表达，是在位置和序列上都比较保守的一类基因。microRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，可以精密调节基因的蛋白合成，能够与靶mRNAs3'端非编码区域(3'-UTR)相结合，使靶基因mRNA降解或沉默从而阻止其迸一步的翻译表达。目前，microRNA被认为是在肿瘤发生发展中起重要作用的因子，microRNA能够同时靶向多个基因，众多的microRNA分子和它们所调控的靶基因在体内形成复杂的网络结构，参与调节肿瘤的发生和细胞恶性生物学行为改变。基因组的不稳定是肿瘤细胞的一个重要特征，所以癌组织的基因表达和同一分化来源的正常组织的基因表达明显不一样，约50％的microRNA基因分布于染色质断裂位点和脆性位点，这些部位属于基因组不稳定部位，因此在不同类型肿瘤中发生的改变也有很大差异。有的miRNA起到癌基因的作用，促进细胞的增殖，促进肿瘤的恶化，促进癌细胞的迁移，有的miRNA则起着抑癌基因的作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管形成。microRNA-203(miR-203)是一个首先在皮肤细胞中鉴定出来的小分子，miR-203基因序列定位于人类染色体14q32上，该区域是不稳定区域，含有52种miRNA的基因序列，编码人类已知约12％的miRNA，成熟的miR-203由22个核苷酸组成，广泛分布于人体各种组织器官，但具有组织分布差异性，是一种皮肤特异性miRNA。研究表明，miR-203启动子甲基化或其他原因可引起大量靶基因如SNAI2、BMI-1、KLF4等表达异常，进而导致肿瘤的发生，miR-203已经被证实在多种肿瘤组织中异常表达，如乳腺癌，膀胱癌，前列腺癌，胰腺癌，肝癌，血液系统肿瘤，食管癌，喉癌等，且在这些肿瘤组织中其含量与正常组织相比具有显著地差异。miR-203的异常表达可以影响肿瘤的增殖、凋亡、血管浸润，及淋巴结转移等恶性生物学行为，Yuan Y等在人食管鳞状细胞癌中的研究表明miR-203可以通过调节ΔNp63介导的细胞通路起到抑制癌细胞增殖的作用。迄今为止，有关miR-203在结直肠癌中表达的研究报道较少，本研究旨在揭示结直肠癌中miR-203的表达情况，研究其对ZNF217基因的调控机制及对肿瘤细胞生物学行为的影响。
　　第一部分
　　ZNF217在结直肠癌中的表达及其与microRNA-203表达的相关性
　　研究目的：
　　1.检测并分析ZNF217在结直肠癌组织与相应正常癌旁组织中是否存在差异表达。
　　2.分析ZNF217的表达与结直肠癌组织的临床病理特征如年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、浸润深度、局部淋巴结转移、远处转移、及临床分期之间的关系。
　　3.分析ZNF217在结直肠癌中的表达与患者预后之间的关系。
　　4.检测结直肠癌组织中miR-203的表达水平，并分析其与ZNF217的表达是否具有相关性。
　　研究方法：
　　1.应用免疫组化方法检测ZNF217在82例结直肠癌患者肿瘤组织及其相应癌旁正常组织中的表达，并分析肿瘤组织中ZNF217表达与结直肠癌患者临床病理特点、与预后之间的关系。
　　2.qRT-PCR方法检测ZNF217mRNA水平和miR-203在结直肠癌组织中的表达，并用Pearson相关分析法分析肿瘤组织中ZNF217与miR-203表达的相关性。
　　结果：
　　1.免疫组化结果显示，ZNF217在结直肠癌组织中的表达水平显著高于相应的癌旁正常组织（P＜0.05）。
　　2.ZNF217的表达水平与结直肠癌患者肿瘤大小（P=0.042）、浸润深度(P=0.03)及局部淋巴结转移（P=0.01）相关，而与年龄、性别、分化程度、远处器官转移与临床分期无显著相关性（P＞0.05）;ZNF217表达水平高的肿瘤患者5年总体生存率低于ZNF217表达水平低的患者（P=0.028）。
　　3.Pearson相关分析结果表明，结直肠癌肿瘤组织中的ZNF217相对表达量miR-203的相对表达量显著负相关(Pearson correlation=0.7431，P＜0.05)。
　　结论：
　　1.ZNF217在结直肠癌癌肿瘤组织较相应癌旁组织表达增高，其表达水平与肿瘤组织的肿瘤大小、浸润深度和局部淋巴结转移呈正相关，ZNF217可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥重要作用。
　　2.ZNF217的表达与miR-203的表达呈负相关，两者可能共同参与了结直肠癌的发病过程。
　　第二部分
　　ZNF217对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
　　研究目的：
　　研究ZNF217在结直肠癌细胞增殖，迁移、侵袭中的作用。
　　研究方法：
　　1.通过脂质体Lipofect2000将siRNA-ZNF217及对应的阴性对照序列转染入结直肠癌细胞中，同时检测转染效率。
　　2.采用MTT检测转染前后结直肠癌细胞增殖能力的变化;Transwell小室检测转染前后结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的变化，探讨ZNF217在结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。
　　结果：
　　与转染siRNA-negative control的对照组细胞相比，siRNA-ZNF217转染组的细胞ZNF217表达水平显著降低，细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱。
　　结论：
　　ZNF217基因表达下降能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
　　第三部分
　　miR-203调控结直肠癌ZNF217基因的研究
　　研究目的：
　　1.生物信息学预测ZNF217的上游microRNA调节基因，并验证二者的靶向关系。
　　2.结直肠癌细胞系中转染miR-203 mimics、miR-203 inhibitor，探讨miR-203异常表达对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的影响。
　　3.探讨ZNF217，miR-203联合异常表达对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的影响。
　　研究方法：
　　1.利用脂质体Lipofect2000分别将miR-203 mimics、miR-203 inhibitor和对应的阴性对照序列转染入结直肠癌细胞中，同时检测转染效率。
　　2.采用MTT法检测转染前后结直肠癌细胞增殖能力的变化;Transwell小室检测转染前后各组结直肠癌细胞增殖迁移和侵袭能力的变化。
　　3.利用生物信息学分析软件TargetScan和micrornaorg预测ZNF217的可能上游调节基因为miR-203;运用荧光素酶报告基因实验，将含有ZNF217基因3'端非编码区序列(WT-ZNF2173'-UTR)或突变序列(MUT-ZNF2173'-UTR)的荧光素酶报告载体分别与miR-203mimics或miR-negative control共转染人胚肾293T细胞，检测各组荧光素酶的活性，验证预测结果;结直肠癌细胞系中转染miR-203 mimics，miR-negative control，利用qRT-PCR和Westemblot方法分别检测转染前后ZNF217 mRNA和蛋白表达水平的变化。
　　4.将miR-203 mimics或miR-negative control与ZNF217-siRNA共转染到结直肠癌细胞系中，然后采用MTT、Transwell法迁检测转染前后细胞增殖、迁移与侵袭能力的变化，探讨ZNF217联合miR-203影响结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。
　　结果：
　　1.miR-203表达增高能够降低结直肠癌细胞增殖、迁移与侵袭能力，反之则引起结直肠癌细胞增殖、迁移与侵袭能力增强(P＜0.05)。
　　2.生物信息学分析软件预测结果显示ZNF217的3'-UTR区含有可与miR-203互补结合的序列;荧光素酶报告基因实验显示，人胚肾293T细胞共转染miR-203 mimics与含WT-ZNF2173'-UTR的荧光素酶报告载体时，细胞的荧光素酶活性明显下降，显著低于对照组(P＜0.05);在转染miR-203mimics的结直肠癌细胞中，ZNF217的mRNA及蛋白水平均显著下降(P＜0.05)。
　　3.和对照组相比，转染siRNA-ZNF217的结直肠癌细胞和转染miR-203 mimics的结直肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力均减弱，而联合转染siRNA-ZNF217和miR-203 mimics与独自转染siRNA-ZNF217的结直肠癌细胞或独自转染miR-203 mimics细胞相比，结直肠癌细胞增殖、迁移与侵袭能力均显著减弱，二者具有一定的协同作用。
　　结论：
　　1.miR-203的表达水平降低能够促进结直肠癌细胞的增殖、而miR-203的表达水平升高能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
　　2.miR-203可以靶向调控ZNF217，ZNF217是miR-203在结直肠癌中的靶基因之一，表明miR-203/ZNF217在结直肠癌的发生发展过程中具有重要的作用，miR-203可通过调控ZNF217的表达改变结直肠癌细胞的生物学行为，二者共同参与结直肠癌的发生发展过程。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 结直肠癌组织中ZNF217和NicroRNA-203表达的相关性

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 ZNF217对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第三部分 miR-203调节结直肠癌ZNF217的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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