Ⅰ高胆固醇饮食诱发大鼠脂源性脂肪因子紊乱；Ⅱ高胆固醇饮食诱发大鼠睾丸内质网应激及功能障碍

摘要

脂肪是一个重要的内分泌器官，可以通过分泌脂肪因子参与调节饮食，能量平衡及糖脂代谢等。脂肪因子被分成两类:一类来源于脂肪组织及机体其他组织，如TNFα;另一类主要来源于脂肪组织，如瘦素，这些脂源性脂肪因子，不仅可以通过自分泌及旁分泌影响脂肪细胞的功能，还可以通过循环系统运送到其他器官及组织影响代谢反应，在探讨内脏脂肪累积与2型糖尿病、心血管疾病、非酒精脂肪肝的发病机制方面起到了不可或缺作用。
　　脂肪组织作为体内甘油三酯存储的主要器官，肥胖致脂肪因子合成及分泌紊乱已被广泛研究。脂肪组织同样是体内最大的胆固醇池，胆固醇储存量可达到总脂质的0.5％。在肥胖状态下，过多胆固醇在脂肪细胞累积导致细胞膨胀，胞膜流动性增高，引起脂肪细胞功能障碍。但目前关于高胆固醇饮食对脂肪合成及分泌脂肪因子功能的影响报道甚少，高胆固醇饮食的非肥胖依赖效应也少有关注。本实验采用与标准饲料等热量添加的胆固醇饲料喂养构建高胆固醇血症大鼠模型，观察高胆固醇饮食对大鼠内脏脂肪组织及血清中脂源性脂肪因子水平的动态影响。
　　本文主要从以下几方面进行了论述:
　　目的:
　　1、观察不同时间高胆固醇饮食喂养大鼠出现胰岛素抵抗情况。
　　2、观察高胆固醇饮食对血清及内脏脂肪组织脂肪因子（瘦素、抵抗素、内脂素、脂联素、磷脂酰基醇蛋白聚糖-4）水平的影响。
　　3、观察不同时间高胆固醇饮食喂养与各脂肪因子水平之间的时效关系。
　　方法:
　　1、动物模型:60只SD大鼠适应性喂养1周后根据体重随机分为普通饮食(NC)组及高胆固醇饮食(HC)组，分别给与标准饲料及高胆固醇添加饲料喂养。
　　2、标本留取:喂养期间第0、4、12、18周由锁骨下静脉抽取空腹血，留取血样;第0、4、18周处死大鼠后留取肾周白色脂肪组织，液氮保存。
　　3、血脂测定:大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯水平由奥林巴斯自动生化仪测定。
　　4、空腹血糖及空腹胰岛素水平测定，计算胰岛素抵抗指数:分别采用葡萄糖氧化酶法及125I-胰岛素放免竞争分析法检测空腹血糖、空腹胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数。
　　5、酶联免疫吸附方法分别检测血清及内脏脂肪组织中脂肪因子的水平。
　　结果:
　　1、高胆固醇饮食喂养大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著增加。
　　2、仅在高胆固醇饮食持续喂养至第18周时大鼠HOMA-IR显著增加，胰岛素抵抗发生。
　　3、长期高胆固醇饮食（18周）增加大鼠内脏脂肪组织瘦素水平。
　　4、高胆固醇饮食诱发大鼠血清及内脏脂肪组织抵抗素呈波动性变化。
　　5、高胆固醇饮食致大鼠内脏脂肪组织内脂素水平早期（4周）减少，后期(18周)升高。
　　6、随着喂养时间的延长，高胆固醇饮食组大鼠血清及内脏组织中脂联素水平逐渐升高。
　　7、长期高胆固醇饮食（18周）升高大鼠内脏脂肪组织中磷脂酰基醇蛋白聚糖-4水平。
　　结论:
　　1、长期高胆固醇饮食喂养的大鼠出现了胰岛素抵抗及脂肪功能紊乱:内脏脂肪组织瘦素、磷脂酰基醇蛋白聚糖-4水平显著升高;内脂素水平早期减少，后期升高;血清及内脏脂肪组织抵抗素水平呈现波动性变化;脂联素水平逐渐升高。
　　2、在过量胆固醇摄入时，脂肪组织可分泌致胰岛素抵抗的脂肪因子，以抵抗素变化最早，最为明显。同时，脂肪组织还可分泌保护作用的脂肪因子，如脂联素。这种变化可能与机体激活的代偿反应有关。上述结果充分说明了脂肪组织在高胆固醇饮食中发挥的重要调节作用。
　　目前男性生殖功能低下发病率逐渐升高并严重影响了人们的生活质量。男性生殖功能低下是由于睾丸生成睾酮及精子能力下降引起的临床综合征，主要表现为低睾酮水平，伴有男性性欲减低、勃起功能障碍、生殖能力下降等临床症状。睾丸作为男性最重要的生殖内分泌器官，在维持男性性征、性行为、保证生殖功能发挥重要作用。睾丸主要功能为产生睾酮及精子。睾酮主要来源于睾丸间质细胞，不仅是维持男性表型的主要雄激素，还参与了骨质疏松、代谢综合征、心血管疾病的发生发展。精子生成主要发生在睾丸曲细精管内，由支持细胞提供营养。
　　胆固醇是人类饮食的主要组成部分，同时也是合成固醇类激素及维生素D的重要原料。但是，过量胆固醇摄入成为心血管疾病、非酒精性脂肪肝、癌症及阿尔茨海默症的独立危险因素，成为增加疾病负担及死亡率的主要原因之一。除了以上几个方面，高胆固醇饮食对男性生殖功能的影响也引起了广泛的临床关注。我们前期的临床流行病学调查在4114名中老年男性中发现血清总睾酮水平与总胆固醇水平呈负相关，与Tobias的研究结论一致。以往的动物实验也在高胆固醇血症大鼠及小鼠中发现睾酮水平降低及精子数量、质量下降。综上研究，我们发现高胆固醇饮食损害男性生殖能力机制尚未明确，可能与睾丸合成睾酮及精子能力下降有关。
　　游离胆固醇可通过以下几个方面介导毒性效应:1.细胞膜流动性丧失:细胞膜上正常的游离胆固醇/磷脂比例是维持细胞膜流动性的重要因素，如果该比值升高，细胞膜上脂质结晶将引起细胞膜流动性的变化;2.破坏膜蛋白功能:游离胆固醇可通过抑制了细胞膜上一种或几种蛋白质功能介导细胞死亡。细胞器膜上的蛋白功能也发生变化，例如内质网膜上的Na+-Ca2+转运蛋白。3.形成胆固醇结晶及氧甾酮:当游离胆固醇/磷脂比值显著升高时，胆固醇可形成针样结晶破坏细胞结构的完整性;过量细胞内游离胆固醇累积还可促进胆固醇氧化，形成有毒的氧甾酮。细胞内过量胆固醇负荷通过破坏内质网膜流动性及膜蛋白功能，导致内质网内未折叠蛋白及错误折叠蛋白的累积，诱发内质网应激。有研究报道高胆固醇饮食可激活小鼠下丘脑和动脉瓣内质网应激，导致意识障碍和动脉瓣钙化。体内试验进一步证实胆固醇负荷的肝脏L02细胞中出现未折叠蛋白反应(UPR)。上述研究表明过量的胆固醇累积可能通过激活内质网应激发挥其毒性作用。而内质网应激是否参与了男性生殖功能损伤仍不明确。
　　目的:
　　1、观察高胆固醇摄入对大鼠血清睾酮水平的影响。
　　2、进一步观察高胆固醇饮食对睾丸间质细胞、支持细胞、生精细胞的影响。
　　3、深入探讨高胆固醇摄入引起睾丸毒性的机制。
　　方法:
　　1、动物模型:60只SD大鼠适应性喂养1周后根据体重随机分为普通饮食(NC)组及高胆固醇饮食(HC)组，分别给与标准饲料及高胆固醇添加饲料喂养。
　　2、标本留取:喂养期间第4、8、12、16周由锁骨下静脉抽取空腹血，留取血样;第16周处死大鼠后留取睾丸组织，多聚甲醛固定或液氮冻存。
　　3、血脂测定:大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯水平由奥林巴斯自动生化仪测定。
　　4、血清睾酮水平测定:采用125I-睾酮放免竞争分析法检测血清睾酮水平。
　　5、采用免疫荧光及免疫组化方法检测间质细胞、支持细胞、生精细胞标志物3β-HSD、WT-1、DAZL在睾丸组织中的表达;HE染色观察睾丸组织整体结构。
　　6、采用RT-PCR检测睾酮合成相关分子StAR，P450scc，3β-HSD，P450c17，17β-HSD对应的mRNA水平。
　　7、采用Western Blotting检测睾酮合成相关分子StAR，P450scc，3β-HSD，P450c17及内质网应激相关指标蛋白水平的变化。
　　结果:
　　1、高胆固醇饮食喂养大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著升高，长期高胆固醇摄入大鼠血清睾酮水平降低。
　　2、高胆固醇饮食持续喂养大鼠睾丸组织游离胆固醇沉积增加。
　　3、高胆固醇饮食大鼠间质细胞、支持细胞、生精细胞标志物表达减少。
　　4、高胆固醇饮食大鼠睾酮合成相关蛋白表达减少。
　　5、高胆固醇饮食大鼠睾丸组织内质网应激激活。
　　结论:
　　1、过量高胆固醇摄入增加血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平的同时，增加了睾丸组织脂质沉积。
　　2、过量胆固醇摄入导致大鼠睾丸功能障碍，表现在血清睾酮水平下降，间质细胞、支持细胞、生精细胞标志物表达减少。
　　3、过量胆固醇摄入介导的睾丸毒性可能与内质网应激密切相关。

目录

声明

摘要

符号说明

高胆固醇饮食诱发大鼠脂源性脂肪因子紊乱

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

课题的创新点与局限性

附录 图表

参考文献

高胆固醇饮食诱发大鼠睾丸内质网应激及功能障碍

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

课题的创新点与局限性

附录 图表

FIGURE LEGENDS

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文