干扰素-γ及自噬相关基因ATG5缺陷对APC突变所致肠道肿瘤的影响

摘要

研究背景：
　　结肠癌严重威胁人类健康。在西方国家，结肠癌成为第二高发癌症，并且，其发病率和死亡率逐年上升。结肠癌的发生与发展是一个多阶段，由多基因参与的分子病理学过程。临床上，约85％的散发性结肠癌病人携带有腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)的突变，APC基因突变在早期可导致结直肠腺瘤，而大部分结肠癌源于结肠腺瘤，腺瘤癌变一般需要十几年时间。
　　干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）作为一种具有抗癌活性的内源蛋白质，受到人们广泛关注。除了重要的抗肿瘤作用外，IFN-γ还具有抗病毒、抗微生物、调节细胞周期、凋亡与分化和调节免疫反应等多种生物学功能。最近的研究报道，IFN-γ及其受体基因的突变与结直肠癌的发病风险及其预后有着密切的联系。然而，关于IFN-γ及其受体在结直肠癌发病过程中的作用及意义尚不明确。本论文第一部分借助经典的APC突变所致肠道肿瘤模型（ApcMin/+小鼠模型）以及APC基因突变背景的人源结肠癌细胞，探讨了干扰素-γ及其受体基因突变对APC突变诱发的肠道肿瘤发生和发展的影响，并对相关机制做了深入研究。
　　细胞自噬是细胞对内外压力的一种适应性反应，细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，形成自噬溶酶体，降解所包裹的内容物，藉此促进细胞的存活和恢复细胞稳态。自噬相关基因-5(autophagy related gene-5，ATG5)是自噬过程中一种重要的ATG基因，参与早期自噬体的形成，在细胞自噬过程起到了重要的作用。ATG5蛋白在正常结肠细胞中有表达，而在23％的结直肠癌患者中发生缺失。尽管发病率较低，但ATG5基因缺陷可能在结肠癌的发病过程中起了重要作用。此外，体外研究表明，ATG5基因经小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)沉默后可以大大增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用。在第二部分，我们利用ApcMin/+小鼠模型和APC基因突变背景的人源结肠癌细胞，探讨了ATG5基因缺陷对APC突变诱发的肠道肿瘤发生和发展的影响，并通过体内实验证明了ATG5基因缺陷可以增强化疗药物对肿瘤的敏感性。
　　第一部分 IFN-γ基因缺陷对APC突变诱发的肠道肿瘤的影响
　　第一节内源性IFN-γ基因缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的影响
　　实验目的:探讨内源性IFN-γ基因缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生发展的影响。
　　实验方法:选用经典的肠道腺瘤模型ApcMin/+小鼠模型以及IFN-γ基因缺陷的小鼠IFN-γ-/-或IFN-γ+/-小鼠，通过杂交繁育和基因鉴定等方法得到子代双基因缺陷的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠。通过比较子代ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠与ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠肠道腺瘤大小和数目，确定IFN-γ缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的影响;通过组织病理学检查得出IFN-γ缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤恶性程度的影响;ELISA法检测IFN-γ基因缺陷对小鼠血清IFN-γ水平的影响;免疫组化法检测IFN-γ缺陷对肠道肿瘤微环境中免疫因子数量和分布的调节作用;进一步对肠道肿瘤进行westernblotting分析，检测IFN-γ基因缺陷对肿瘤组织中IFN-γ信号通路、Wnt/β-catenin以及EGFR/Erk1/2等信号通路的调控作用。
　　实验结果:小鼠正常饲养至6月龄时，大多数ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠状态良好，而接近半数的ApcMin/+IFN-γ+/-小、鼠发生死亡，其余存活的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠状态较差，大多出现便血或脱肛。解剖发现，与ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠相比，ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠肠道腺瘤的大小和数目都有显著的增加。组织病理学结果表明，41.7％的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠的肠道腺瘤发生了癌变。ELISA法检测发现杂合性的IFN-γ缺陷降低了小鼠血清中IFN-γ水平;免疫组化检测结果表明，IFN-γ缺陷可以调节肠道肿瘤微环境中免疫因子CD4、CD8及F4/80的数量和分布，进而限制了ApcMin/+小鼠的抗肿瘤细胞免疫能力。Western blotting实验发现，杂合性IFN-γ缺陷对IFN-γ信号通路具有一定的抑制作用，并且激活了肿瘤相关信号通路Wnt/β-catenin和 EGFR/Erk1/2，促进肿瘤的生长。因此，IFN-γ缺陷可以促进ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发展，并且可以促使良性的ApcMin/+小鼠肠道腺瘤发生癌变。这一作用可能与IFN-γ缺陷对Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等肿瘤相关信号通路的活化作用有关。
　　实验结论:IFN-γ在APC突变诱发的肠道肿瘤发生发展过程中扮演了限速因子的角色，这个结果揭示了IFN-γ在癌症生物学中的一个新的作用。
　　第二节干扰素-γ受体基因缺陷对APC突变背景的人源结肠癌细胞株生长的影响
　　实验目的:通过体外试验，检测IFN-γ受体基因发生缺失对结肠癌细胞生长的影响。
　　实验方法:使用转染试剂lipofectamineTM2000进行小干扰RNA细胞转染试验，下调HT-29结肠癌细胞中的IFNγR1基因水平;使用western blotting法检测IFNγR1蛋白的表达水平，确定IFNγR1基因的沉默效率。通过MTT法检测IFN-γ对HT-29细胞以及IFNγR1基因沉默的HT-29细胞的抑制作用，进一步验证IFNγR1基因的沉默效果;通过MTT实验和细胞克隆形成实验检测IFNγR1沉默对HT-29结肠癌细胞增殖的影响;通过使用western blotting法检测IFNγR1沉默对HT-29细胞中Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等肿瘤相关信号通路的影响。使用MTT法反方向验证外源性IFN-γ对HT-29和HCT-116结肠癌细胞增殖的抑制作用，通过westernblotting法检测IFN-γ抑制结肠癌细胞增殖的机制。
　　实验结果:通过lipofectamineTM2000转染IFNγR1-target siRNA，下调了HT-29细胞中IFNγR1水平，western blotting试验发现，siRNA可以显著降低HT-29结肠癌细胞中的IFNγR1蛋白水平，沉默效率达70％以上。MTT法检测发现IFN-γ对IFNγR1沉默的HT-29细胞的抑制作用不敏感，从而进一步证实了IFNγR1蛋白水平被有效下调。细胞克隆形成试验得出，与沉默无关序列相比，沉默IFNγR1后HT-29细胞的克隆形成能力明显增强。Western blotting结果显示IFNγR1沉默显著促进了Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信号通路。进一步MTT检测结果表明，IFN-γ可显著抑制APC突变背景的人源结肠癌细胞HT-29的增殖，抑制作用呈现时间和剂量依赖性，而IFN-γ对野生型APC基因背景的HCT-116人源结肠癌细胞的增殖无明显抑制作用。利用western blotting方法进一步检测了IFN-γ对HT-29细胞的作用机制，结果表明，IFN-γ刺激促进了STAT1磷酸化，激活了HT-29细胞中的IFN-γ信号通路，并且，IFN-γ可抑制HT-29细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，通过增加β-catenin的磷酸化进而促进β-catenin的降解。
　　实验结论:IFN-γ可显著抑制APC突变背景的人源结肠癌细胞HT-29的增殖，而对野生型APC基因背景的HCT-116人源结肠癌细胞的增殖无显著影响。沉默IFNγR1可促进HT-29细胞的克隆形成，此作用可能与对肿瘤相关信号通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的调节作用相关。
　　第二部分自噬相关基因ATG5缺陷对APC突变诱发的肠道肿瘤的影响
　　第一节内源性ATG5基因缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的影响（体内试验）
　　实验目的:探讨内源性ATG5基因缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发展的影响。
　　实验方法:由于ATG5-/-小鼠是无法存活的，在这里，我们使用肠道腺瘤模型小鼠ApcMin/+以及ATG5基因杂合性缺失的ATG5+/-小鼠，通过杂交繁育和基因鉴定等方法得到子代ATG5缺陷的ApcMin/+小鼠模型。通过比较子代ApcMin/+ATG5+/+与ApcMin/+ATG5+/-小鼠肠道腺瘤的大小和数目，确定ATG5缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤生长的影响;通过组织病理学试验得出ATG5缺陷对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤恶性程度的影响;进一步对肠道肿瘤进行western blotting分析，检测ATG5缺陷对肿瘤组织中自噬信号、凋亡相关信号通路、Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等肿瘤相关信号通路的调控作用。
　　实验结果:基因缺陷小鼠生长至4月龄时，解剖发现，ApcMin/+ATG5+/+小鼠与ApcMin/+ATG5+/-小鼠相比，肠道腺瘤的大小和数目无明显差异(P＞0.05);小鼠生长至6月龄时，解剖发现，与ApcMin/+ATG5+/+小鼠相比，ApcMin/+ATG5+/-小鼠肠道腺瘤的数目有所增加，达到显著性差异。组织病理学结果表明，杂合性ATG5缺陷不足以引起ApcMin/+小鼠的肠道腺瘤发生癌变，对肠道腺瘤的恶性程度无显著影响。Western blotting实验发现，杂合性ATG5缺陷对肠道肿瘤细胞凋亡及自噬通路无显著影响，但激活了肿瘤相关的Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信号通路，促进了肿瘤的生长。
　　实验结论:杂合性ATG5缺陷可以促进ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的生长，但不足以引起ApcMin/+小鼠肠道腺瘤发生癌变。ATG5缺陷对肠道肿瘤生长的促进作用可能与对Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等肿瘤相关信号通路的促进作用有关，而与细胞的自噬和凋亡作用无关。
　　第二节 ATG5基因缺失对APC突变背景的结肠癌细胞株HT-29生长的影响（体外实验）
　　实验目的:确定ATG5基因缺失对结肠癌细胞生长的影响。
　　实验方法:使用lipofectamineTM2000转染ATG5-target siRNA，下调HT-29结肠癌细胞中的ATG5基因水平;western blotting法检测ATG5蛋白的表达水平，确定ATG5基因的沉默效率。通过MTT法检测沉默ATG5对HT-29细胞增殖的影响;通过细胞克隆形成实验检测ATG5沉默对HT-29结肠癌细胞克隆形成能力的影响。
　　实验结果:使用ATG5-target siRNA，通过lipofectamineTM2000转染试剂转染HT-29结肠癌细胞，western blotting试验发现，siRNA可以显著降低ATG5的蛋白水平，沉默效率达90％以上。MTT法检测发现，ATG5沉默后HT-29细胞的增殖被显著抑制。细胞克隆形成试验得出相同的结论，即与沉默无关序列相比，沉默ATG5之后HT-29细胞的克隆形成能力受到显著抑制。
　　实验结论:ATG5沉默可以显著抑制HT-29细胞的增殖，并且显著抑制了HT-29细胞的克隆形成。我们推测，ATG5缺失方式的不同以及实验动物种属的差异等原因可能是造成体内外实验结果不一致的因素。
　　第三节 ATG5基因缺陷显著提高IFN-γ对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的抑制作用
　　实验目的:通过动物实验，验证ATG5基因缺陷可以提高抗肿瘤药物的药效作用。
　　实验方法:使用肠道腺瘤ApcMin/+小鼠模型和杂合性ATG5缺陷的ATG5+/-小鼠模型，通过杂交繁育和基因鉴定等方法得到子代ApcMin/+ATG5+/-和ApcMin/+ATG5+/-小鼠模型。采用腹腔注射鼠源IFN-γ的方法，比较IFN-γ早期预防给药以及晚期治疗给药前后ApcMin/+ATG5+/+与ApcMin/+ATG5+/-小鼠肠道腺瘤大小、数目的变化，通过组织病理学检验分析给药前后小鼠肠道肿瘤恶性程度的变化，确定杂合性ATG5缺陷对IFN-γ疗效的影响，进一步确定ATG5基因缺陷是否可以提高IFN-γ对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的抑制作用。通过对小鼠进行摄食量、体重及血常规检测，分析IFN-γ给药所引起的毒性反应。通过western blotting分析，检测ATG5缺陷对IFN-γ诱导的肿瘤相关信号通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的影响。
　　实验结果:早期IFN-γ预防给药于肠道肿瘤尚未出现时开始，给药3个月，中间休息一个月，晚期IFN-γ治疗给药于肿瘤出现之后开始，给药方式相同。给药结束后解剖发现，早期IFN-γ预防给药后，ApcMin/+ATG5+/-小鼠肠道腺瘤的数目与阴性对照组（给予生理盐水）的ApcMin/+ATG5+/-小鼠相比明显减少，下降了95.5％，组织病理学发现，给药后，ApcMin/+ATG5+/-小鼠的肠道腺瘤极少，大多数部位仅见增生。而ApcMin/+ATG5+/+小鼠早期给药IFN-γ后，肠道腺瘤数目较阴性对照组的ApcMin/+ATG5+/+小鼠虽有所减少，下降了43.3％，但仍见数目较多的肠道腺瘤以及较为严重的发育不良等病理学特征。因此，ATG5缺陷可大大提高IFN-γ早期预防给药的效果。此外，ATG5缺陷还可提高晚期IFN-γ给药的药效，但提高的幅度较早期给药小。鉴于早期IFN-γ给药出现的良好的腺瘤抑制效果，我们进一步检测了IFN-γ给药的毒性反应。研究发现，IFN-γ给药对小鼠摄食量和体重无明显影响;血常规结果表明，IFN-γ给药后不仅未出现白细胞、血小板等血细胞的减少，反而出现血小板的略微上升，因此IFN-γ给药可能有助于提高小鼠的自身免疫水平。Western blotting分析发现，ATG5缺陷提高了IFN-γ对肿瘤相关信号通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的抑制作用，进而提高了对肿瘤生长的抑制效果。
　　实验结论:ATG5基因缺陷提高了IFN-γ对ApcMin/+小鼠肠道腺瘤的抑制作用，此作用与ATG5缺陷提高了IFN-γ对Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信号通路的抑制作用有关，此结论与文献所报道的体外细胞水平的实验结论一致，即ATG5基因缺陷可以提高抗肿瘤药物的药效。总的来说，ATG5在肠道肿瘤的发生发展过程中起了重要的作用，IFN-γ治疗与ATG5基因缺陷或ATG5靶向抑制相结合可能成为结肠癌预防和治疗的新方法。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 结肠癌综述

1．1 结肠癌的发病机制

1．2 调控结肠癌发生发展的基因

1．3 APC基因与结直肠癌

2 ApcMin／+小鼠模型

2．1 ApcMin／+小鼠模型介绍

2．2 ApcMin／+小鼠模型的应用

2．3 双基因突变小鼠模型介绍

2．4 双基因缺陷小鼠模型的建立和应用

3 IFN-γ基因缺陷与肠道肿瘤

3．1 IFN-γ及其受体基因概述

3．2 IFN-γ及其受体基因缺陷在肠道肿瘤研究中的意义

4 自噬相关基因ATG5缺陷与肠道肿瘤

4．1 自噬相关基因ATG5概述

4．2 ATG5基因缺陷在肠道肿瘤研究中的意义

4．3 ATG5基因缺陷在肠道肿瘤治疗中的意义

第一部分 干扰素-γ基因缺陷对APC突变所致肠道肿瘤的影响

第一节 内源性干扰素-γ基因缺陷对ApcMin／+小鼠肠道肿瘤的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与结论

第二节 干扰素-γ受体基因缺失对APC突变背景的结肠癌细胞生长的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与结论

第二部分 自噬相关基因ATG5缺陷对APC突变诱发的肠道肿瘤的影响

第一节 内源性ATG5基因缺陷对ApcMin／+小鼠肠道肿瘤的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与结论

第二节 ATG5基因敲除对APC突变背景的结肠癌细胞生长的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与结论

第三节 ATG5基因缺陷显著提高了干扰素-γ对ApcMin／+小鼠肠道肿瘤的抑制作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与结论

全文总结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

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