里氏木霉中Tmk3途径的作用及机理研究

摘要

里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种重要的工业纤维素酶高产菌株，也是生产纤维素酶的模式菌株。里氏木霉属于红褐肉座菌的无性型，又因其对环境和人类是安全无毒的，因此近年来，越来越多的精力集中在里氏木霉的研究及菌株改造上。
　　里氏木霉通过感知外界环境刺激来分泌大量胞外蛋白，从而产生高纤维素酶，这个过程要依赖一系列的信号传导途径来完成。其中，在丝状真菌中，比较重要的信号传导途径是MAPKs途径，这条途径在真菌中是很保守的，在酵母中研究的最为深入，但是在T.reesei中还没有被研究过，他们由一系列激酶组成，通过磷酸化作用来发挥功能。已有报道显示，丝状真菌中主要有三种不同MAPK途径，分别与酵母中Hog1p，Slt2p，and Fus3p同源，并且这些MAPKs也表现出很多生理功能，例如对压力反应，生物合成，分生孢子形成，致病性，细胞壁完整性等等。在丝状真菌中，Hog1p途径的功能是相对保守的，在Aspergillusnidulans和Trichoderma harzianum中主要功能涉及到到渗透压的抵抗性。在烟曲霉中，与酵母Slt2p同源的MAPK主要涉及到维持细胞壁的完整性，而酵母Fus3p的同系物涉及到很多不同的生理过程，其中一个重要的生理功能是配糖体水解酶。在T.reesei中体外模拟重建MAPK信号传导途径确认出了3个不同的途径，这3个MAPKs途径包括:酵母Fus3p的同系物Tmk1，Slt2p同系物Tmk2和Hog1p同系物Tmk3。本研究以Tmk3为重点，深入研究其在里氏木霉中的生理功能及作用机制。
　　为了探究Tmk3生理功能，我们利用同源重组原理构建了里氏木霉Tmk3基因敲除菌株T.reesei△tmk3，在高渗透压下，我们发现敲除株对NaCl敏感性提高，并且甘油和海藻糖合成基因的转录水平下调;此外本文探究了Tmk3对细胞壁的影响，发现在敲除株中儿丁质和B-1，3-葡聚糖合成酶基因的转录水平下调，并且在显微镜下观察出发株和敲除株菌丝，可以看到敲除株菌丝表面凹凸不平有牙状突起，通过平板表型分析，发现敲除株对细胞壁干扰物刚果红和荧光增白剂敏感性增强。
　　为了探究Tmk3对纤维素酶的影响，在产酶培养基中，测量了出发株和敲除株的胞外蛋白含量和纤维素酶酶活及纤维素酶和转录调控因子编码基因的转录水平，发现敲除株较出发株在纤维素酶、蛋白含量及转录水平上都下调很多。
　　最后，我们把出发株和敲除株在固态下培养，发现敲除株中几丁质和B-1，3-葡聚糖合成酶编码基因、甘油和海藻糖合成基因、纤维素酶编码基因转录水平和生物量在固态下都有所恢复;并且敲除株的蛋白含量和纤维素酶酶活在固态下也恢复很多。综上，我们发现Tmk3在里氏木霉中参与细胞壁完整性、高渗透压抵抗性及纤维素酶合成调控，并且本文发现T.reesei在固态下生长更加良好，这也与自然界中他们的固态生长环境相吻合。
　　此外，本文探究了Tmk3影响纤维素酶合成的调控机制。为了探究Tmk3磷酸化作用底物是否是转录调控因子，通过酵母双杂交、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)方法探究Tmk3与Xyr1、Cre1、Ace1和Ace2是否有相互作用;为了探究Tmk3诱导纤维素酶合成调控的方式和机理，构建了Tmk3与GFP融合蛋白，来检测在外界信号刺激下Tmk3是否发生从细胞质到细胞核的亚细胞定位改变。

目录

声明

摘要

符号说明及缩略词

第一章 绪论

1．1 生物质能源的研究背景

1．2 丝状真菌里氏木霉

1．3 里氏木霉中主要纤维素酶及其作用机制

1．4 诱导因子及纤维素酶、半纤维素酶的诱导表达方式

1．5 里氏木霉中调控纤维素酶的转录因子

1．6 MAPK信号代谢途径

1．7 立题依据和主要研究内容

第二章 里氏木霉中tmk3的敲除和tmk3生理功能的研究

2．1 材料及方法

2．1．1 菌株

2．1．2 常用仪器设备

2．1．3 常用的培养基和溶液及配方

2．1．4 实验方法

2．2 实验结果与讨论

2．2．1 Δtmk3：：pyr4敲除株的构建及验证

2．2．2 出发株和敲除株在不同碳源平板上表型分析

2．2．3 出发株和敲除株摇瓶及固态培养下生物量的测定

2．2．4 Δtmk3敲除株对渗透压抵抗性及细胞壁受损分析

2．2．5 出发株和Δtmk3敲除株在液态和固态培养下纤维素酶酶活和蛋白的测定

2．2．6 出发株和Δtmk3敲除株在转录水平上的分析

2．3 本章小结

第三章 Tmk3对里氏木霉中纤维素酶合成的调控机制的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株

3．1．2 主要试剂和试剂盒

3．1．3 主要实验仪器

3．1．4 主要培养基和溶液及其配方

3．1．5 主要实验方法及其原理

3．2 实验结果与讨论

3．2．1 以麸皮为碳源探宄tmk3的组成型调控和诱导型调控

3．2．2 通过免疫共沉淀(Co-IP)探究Tmk3与之相互作用的蛋白

3．2．3 酵母双杂交实验探究Tmk3与转录因子之间的相互作用

3．2．4 构建Tmk3与GFP融合蛋白探究激酶Tmk3亚细胞定位

3．2．5 双分子荧光互补实验(BiFC)探究Tmk3与转录因子之间相互作用

3．3 本章小结

全文总结与展望

参考文献

硕士期间取得成果

致谢