AICAR诱导激活的AMPK在肝脏抑制TSH/SREBP-2/HMGCR通路

摘要

目的:
　　研究AMPK在肝脏中是否可通过SREBP-2在调节肝脏胆固醇代谢中起到积极作用，以及是否AMPK对TSH介导的SREBP-2的上调具有影响，这也许可为将来临床治疗与TSH相关的高胆固醇血症提供依据。
　　方法:
　　1.体外实验:在HepG2细胞中，用AMPK激动剂AICAR、TSH分别处理细胞，用SAMS试验检测AMPK活性变化，观察SREBP-2胞浆前体及核内活性形式及其靶基因HMGCR、HMGCS的表达变化。
　　2.体内试验:采用野生型(Tshr+/+)和TSH受体敲除（Tshr-/-）小鼠，AMPK激动剂AICAR腹腔注射Tshr+/+和Tshr-/-小鼠，观察胞浆及核内成熟体SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的表达变化。
　　3.用AMPK激动剂AICAR处理HepG2细胞，2×Flag-SREBP-2质粒瞬时转染表达SREBP-2核内活性形式，免疫沉淀SREBP-2、免疫印迹丝氨酸或苏氨酸磷酸化抗体验证AMPK可磷酸化SREBP-2核内活性形式。
　　4.在AMPK激动剂AICAR处理HepG2、L02细胞、Tshr-/-、Tshr+/+小鼠，肝细胞总蛋白免疫沉淀SREBP-2、免疫印迹丝氨酸或苏氨酸磷酸化抗体验证AMPK可磷酸化SREBP-2胞浆前体形式。
　　5.双重免疫荧光染色法验证TSH对AMPK磷酸化SREBP-2的抑制作用。
　　6.主要技术:Real-Time PCR、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光、质粒瞬时转染及建立小鼠试验模型等。
　　结果:
　　1.TSH在HepG2细胞上调SREBP-2蛋白水平和HMGCR、HMGCS的表达。
　　SREBP-2在肝脏优先调节负责胆固醇合成与吸收的靶基因如HMGCR、HMGCS，在给予TSH(4μM)处理HepG2细胞，SREBP-2前体及核内活性形式被发现呈时间依赖方式增加。TSH处理后HMGCR的mRNA在24小时和48小时均上调，HMGCS的mRNA在48小时上调(p＜0.05）。
　　2.HepG2细胞AICAR激活AMPK可直接抑制SREBP-2的表达。
　　SREBP-2可在多个水平被调控如固醇反馈机制或转录水平、翻译后修饰等多个方面，曾有证据表明SREBP-2是AMPK的一个直接靶点，AMPK可直接抑制SREBP-2的转录活性。为了探讨AMPK激活后是否对SREBP-2的前体和核内形式具有调节作用，HepG2细胞给予AMPK的激动剂AICAR处理12小时和24小时，作为AMPK激活的标志，磷酸化AMPK和磷酸化ACC水平明显增加并且呈时间依赖性，SREBP-2前体在AICAR孵育12小时有一个轻度减少，而在处理24小时跟随着出现一个明显减少，但是SREBP-2的核内形式在整个处理期间呈现一个明显连续减少。
　　为证实这种变化，我们用实时PCR监测SREBP-2的mRNA水平，AICAR诱导激活的AMPK以时间依赖方式减少了SREBP-2的mRNA水平。在AICAR处理HepG2细胞，核内SREBP-2的免疫荧光强度明显降低。
　　3.AICAR处理的Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠肝脏中，AMPK激活可减少SREBP-2蛋白及其靶基因表达。
　　早先曾有报道在甲状腺及肝脏中TSH能够抑制AMPK活性。为了进一步研究TSH和AMPK对SREBP-2的影响，我们建立Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠模型，与Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠肝脏中SREBP-2前体及核内形式均减少了，尽管确切机制尚不清楚。HMGCR的mRNA水平也明显减少，HMGCS的mRNA呈现一个减少趋势。
　　在PBS处理的Tshr-/-小鼠相较于Tshr+/+小鼠，小鼠肝脏中AMPK活性增加，而且，Tshr-/-小鼠肝脏中SREBP-2的前体及核内蛋白均明显减少。在AICAR处理的Ts hr-/-和Tshr+/+小鼠的肝脏，AMPK活性增强，SREBP-2蛋白水平降低。AICAR导致一个HMGCR mRNA明显降低。
　　4.HepG2细胞AICAR激活AMPK可抑制TSH诱导的SREBP-2的上调。
　　为了进一步验证TSH对AMPK活性的影响，在体外我们采用SAMS多肽磷酸化试验，HepG2细胞给予TSH处理后，AMPK活性明显降低，而AICAR处理HepG2细胞后，AMPK活性明显增强。下一步我们研究TSH诱导的SREBP-2上调是否通过AMPK激活，我们发现TSH诱导上调的SREBP-2的前体及核内形式可被AICAR减轻。
　　为了明确AMPK激活抑制SREBP-2后的功能结果，用实时PCR评价SREBP-2的靶蛋白酶的转录水平变化，同动态变化的SREBP-2蛋白一致，在HepG2细胞中TSH刺激升高的HMGCR和HMGCS的mRNA水平被AICAR减弱。
　　5.在AICAR诱导AMPK激活的细胞及小鼠肝脏中，SREBP-2的苏氨酸位点可被磷酸化。
　　AMPK作为一个进化的保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节关键代谢过程中具有重要作用，可磷酸化多种涉及脂肪酸氧化、胆固醇合成过程中间酶激活或者抑制这些酶的活性。近来研究证实在HEK293细胞和LDLR敲除小鼠肝脏中，SREBP-2是AMPK的直接靶点。为了研究AMPK是否涉及到SREBP-2的磷酸化修饰，我们利用特异性苏氨酸磷酸化抗体和丝氨酸磷酸化抗体，首先SREBP-2抗体免疫沉淀总蛋白，使用苏氨酸磷酸化抗体和丝氨酸磷酸化抗体进行免疫印迹分析，显示SREBP-2的前体和核内形式均有苏氨酸位点磷酸化，SREBP-2无丝氨酸位点磷酸化。我们已经显示在Tshr-/-小鼠较Tshr+/+小鼠AMPK活性增强，同前述的结果一致，在Tshr-/-小鼠中内源性SREBP-2前体苏氨酸磷酸化的水平增加。在人肝L02细胞中也得到相似结果。
　　6.AMPK磷酸化SREBP-2，而TSH可抑制AMPK对SREBP-2的磷酸化。
　　结论:
　　1.AMPK在肝脏可抑制TSH介导的对SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的上调作用。
　　2.AMPK可直接磷酸化SREBP-2前体及核内活性形式的苏氨酸位点。
　　3.TSH与AMPK相互作用影响SREBP-2的磷酸化进而调节SREBP-2活性。

目录

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摘要

符号说明

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

课题的创新点与局限性

附图表

参考文献

综述 能量感受器AMPK在肝脏生理和病理过程中的作用

致谢

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