Peroxynitrite致小鼠耳蜗毛细胞损伤及凋亡机制的研究

摘要

本文主要从以下几方面进行了论述：
　　第一部分 Peroxynitrite对体外培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡机制的研究
　　实验目的:研究Peroxynitrite（过氧亚硝酸盐，ONOO-）对体外培养小鼠耳蜗基底膜毛细胞的损伤作用，并进一步探讨Peroxynitrite致耳蜗毛细胞凋亡的途径及其机制。
　　实验方法:选取出生后3天的健康C57小鼠，应用耳蜗显微解剖技术解剖出耳蜗基底膜，进行体外原代培养，采用免疫组织化学荧光染色法和透射电镜检测毛细胞的损伤并使用TUNEL法检测毛细胞的凋亡。实验分为五组。第一组的实验组采用全耳蜗基底膜培养24小时后，分别加入终浓度为50μM、100μM、200μM Peroxynitrite处理24小时，正常对照组不加药物处理，继续培养24小时后，进行肌球蛋白7a免疫荧光组织化学共染色。第二组的实验组体外培养24小时后加入终浓度为100μM的Peroxynitrite，而正常对照组不作药物处理，继续培养24小时，按步骤制作成电镜观察所需标本，透射电镜下观察毛细胞损伤的超微结构改变。第三组的实验组及对照组处理同第一组，按照TUNEL试剂盒说明书进行TUNEL染色。第四组实验标本处理同第二组，进行Myosin7a，凋亡诱导因子和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3的免疫荧光共染色。第五组取C57新生P3小鼠耳蜗基底膜及蜗轴的中转部分（保留好完整的神经纤维及神经节的连接）进行体外培养24小时，实验组加入浓度为100μM的Peroxynitrite进行药物损伤，继续培养24小时后，免疫荧光法进行Neuronal ClassⅢβ-Tubulin Polyclonal Antibody(Tuj-1)和Casepase-3的共染色。共聚焦显微镜下观察毛细胞(Hair cell，HC)及听力神经纤维（Auditory-nerve fibers，ANF）、螺旋神经节(Spiml ganglionneuron，SGN)的损伤及HC的凋亡状况，选取一定距离的图片进行细胞计数，并利用SPSS17.0和Graphpad Prism5.0软件进行统计分析。
　　实验结果:第一组实验组Peroxynitrite50μM处理24小时后:顶回毛细胞与对照组比较未见明显形态学改变和数目的减少，毛细胞排列规整;中回的三排外毛细胞排列尚规则，数量可见轻微减少，内毛细胞排列整齐，未见损伤改变;底回外毛细胞可见排列紊乱，数量减少，部分细胞固缩呈小圆形或立方形态，呈亮绿色荧光;该组总的毛细胞计数存活率为正常对照组的86.99±1.64％，与正常对照组比较差异不显著。Peroxynitrite100μM处理24小时后:顶回毛细胞与对照组比较排列尚可，第三排外毛细胞偶见缺失;中回毛细胞排列紊乱，可见损伤细胞固缩呈小圆形或立方形态，数目明显减少;底回毛细胞排列显著紊乱，部分聚集成巢团状，损伤细胞呈固缩或圆形或立方形态，毛细胞数目减少明显;总的毛细胞存活率降至47.20±2.24％，与正常对照组比较差异显著。Peroxynitrite200μM处理24小时后:顶回毛细胞即出现排列紊乱，外毛细胞可见缺失和损伤的形态学改变;中回外毛细胞显著减少至部分消失，残存细胞排列紊乱，呈巢团状聚集，显示亮绿色荧光;底回毛细胞大部分消失，残存少量毛细胞;总的毛细胞计数存活率降至19.81±3.51％，与正常对照组比较差异显著。
　　第二组实验组Peroxynitrite100μM处理后可见外毛细胞的表皮板出现部分溶解，静纤毛数目稀少，排列不规则，可见倒伏及区域性缺失;Peroxynitrite200μM处理组与正常对照组的毛细胞比较细胞体积缩小，呈立方状，细胞浆内可见较多胞质空泡，细胞器严重损伤并明显减少，静纤毛数目明显减少，甚至大部分缺失，细胞核染色质浓聚。未检测到明显自噬现象。
　　第三组实验组中可观察到毛细胞（Myosin7a染色阳性，呈红色荧光）出现了TUNEL染色（呈绿色荧光）的阳性凋亡信号（呈黄绿色荧光），还可见到毛细胞细胞质收缩，细胞形态呈固缩的圆形或立方状等细胞损伤的形态学变化并有散在性毛细胞缺失。进一步计数凋亡毛细胞的数目并进行统计学分析，结果显示正常对照组未出现明显的毛细胞凋亡，而实验组Peroxynitrite100μM组作用于基底膜24小时后，毛细胞凋亡率升高至40.27±3.26％，而Peroxynitrite200μM处理组毛细胞凋亡率升高至60.55±3.54％，正常对照组和Peroxynitrite50μM处理组的细胞凋亡率分别为4.36±1.47％和6.31±0.99％，差异无明显统计学意义(P＞0.05)。统计学分析显示Peroxynitrite100μM组和200μM组毛细胞凋亡率较正常对照组比较，差异显著(P＜0.001)。
　　第四组实验组损伤的毛细胞未见与Casepase-3的共染色，而AIF于Myosin7a染色阳性的毛细胞细胞核的位置出现了点状的红色荧光，证明AIF于损伤毛细胞出现了核转位的现象，对照组未检出Casepase-3的阳性信号和AIF的核转位现象。
　　第五组取耳蜗蜗轴的中转部分的毛细胞和神经纤维、神经节细胞连接处培养，免疫荧光染色发现实验组Tuj-1染色阳性的SGN细胞出现了与Casepase-3的共阳性染色，而对照组未发现Casepase-3的阳性染色。
　　实验结论:研究证明了Peroxynitrite可导致新生小鼠耳蜗毛细胞数目的减少并诱导其发生凋亡，支持氧化应激是耳蜗毛细胞的损伤机制之一;体外培养的新生小鼠耳蜗毛细胞随着Peroxynitrite浓度的升高损伤逐渐加重，且有从顶回向底回依次加重的趋势，底回毛细胞对Peroxynitrite的损伤最为敏感;非Caspase依赖性凋亡途径参与了Peroxynitrite致小鼠耳蜗基底膜毛细胞的凋亡过程;Casepase依赖性凋亡通路参与了Peroxynitrite致耳蜗SGN的凋亡过程。
　　第二部分 Wnt信号途径激动剂和抑制剂在Peroxynitrite致小鼠耳蜗毛细胞损伤过程中的调控作用
　　实验目的:研究Wnt3a(Wnt信号激动剂)及IWP-2（Wnt信号抑制剂）在Peroxynitrite致新生小鼠耳蜗毛细胞损伤过程中的调控作用，并进一步探讨Wnt信号途径调控毛细胞凋亡或修复损伤的可能机制。
　　实验方法:选取C57新生P3健康小鼠，应用耳蜗显微解剖技术解剖出耳蜗基底膜，体外原代培养24小时后，正常对照组更新培养液后继续培养24小时;实验组进行药物处理分为四组，分别加入合适浓度的Peroxynitrite、Wnt3a+Peroxynitrite、IWP-2、IWP-2+Peroxynitrite，继续培养24小时，采用免疫荧光及TUNEL染色法，一抗为Myosin7a标记毛细胞，DAPI染色细胞核，共聚焦显微镜观察毛细胞的损伤，并选取图片进行毛细胞计数，并利用SPSS17.0和Graphpad Prism5.0软件进行统计分析。
　　实验结果:第一组100μM Peroxynitrite作用于耳蜗基底膜24小时后，毛细胞可见不同程度的缺失，尤以外毛细胞为重，残存的外毛细胞排列紊乱，部分呈巢团状聚集，数目减少，毛细胞可见形态学改变，如细胞核浓缩，细胞浆可见收缩，细胞较正常毛细胞体积缩小呈圆形或立方形，损伤的毛细胞显示亮绿色，而内毛细胞缺失相对较少，毛细胞总存活率为48.50±2.349％。第二组同时加入较低浓度的Wnt3a(25 ng/ml)处理，结果显示内、外毛细胞排列规整，着色均匀、结构清晰，偶见缺失，毛细胞损伤明显减少，与正常对照组比较，细胞存活率为92.50±1.62％，存活细胞数下降不显著(P=0.065)，而与单独Peroxynitrite处理组比较毛细胞存活率明显升高，差异显著(P值均＜0.05)。TUNEL染色结果显示，正常对照组和Wnt3a+Peroxynitrite组的细胞凋亡率分别为2.25±0.84％和5.00±1.18％，二者差异不显著(P=0.078)，但与单独100μM Peroxynitrite处理组的毛细胞凋亡率（45.28±1.67％）比较差异显著(P＜0.01)。第三组实验结果显示当给予Wnt信号抑制剂IWP-2时，总的毛细胞存活率为98.33±3.54％，与对照组比较未见明显降低(P＞0.05)，而与单纯Peroxynitrite处理组比较存活率明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。第四组实验结果显示IWP-2+Peroxynitrite处理组毛细胞存活率降至正常对照组的43.75±2.85％，与正常对照组和单独IWP-2处理组比较总的毛细胞数目明显减少，差异显著（P值均＜0.01），但与单独Peroxynitrite处理组比较毛细胞的存活率未见明显下降(P=0.618)。
　　实验结论:证明Peroxynitrite可耳蜗诱导新生小鼠耳蜗毛细胞发生氧化损伤并导致凋亡;Wnt3a对Peroxynitrite引起的小鼠耳蜗毛细胞损伤具有保护作用，提示Wnt信号途径在Peroxynitrite致耳蜗毛细胞损伤的过程中具有正调控作用;IWP-2并未加重Peroxynitrite引起的毛细胞的损伤作用，且对毛细胞单纯的体外培养无明显损伤或抑制生长的作用。对于感音神经性耳聋患者而言，Wnt3a有望作为潜在的抗氧化剂，对于毛细胞氧化损伤起到保护或修复毛细胞氧化损伤的作用.

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 Peroxynitrite对体外培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡机制的研究

研究背景

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 Wnt信号途径对Peroxynitrite致耳蜗毛细胞损伤作用的调控及机制探讨

研究背景

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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附文