甘草素对人舌癌Cal-27细胞系增殖及凋亡作用的影响

摘要

在我国，口腔颌面部的恶性肿瘤以癌为最常见，其中又以鳞状细胞癌最为多见，一般占80％以上。鳞状细胞癌多发生于40～60岁成人，男性多于女性。其中又以舌癌最多见。舌癌具有生长快、恶性程度高、浸润性强等特点。目前对于舌癌的治疗方法主要是手术治疗、放射治疗、化学治疗等为主的综合序列治疗，但经长期观察患者的五年生存率仍然比较低，因此为了减少舌癌的局部复发和远处转移，提高患者的生存质量，寻求有效的预防途径以及治疗药物提高对舌癌的治疗的疗效，显得十分迫切和必要。
　　近些年来，寻找具有抗恶性肿瘤作用的生物活性物质，来预防和治疗恶性肿瘤目前已经成为国内外研究的热点。相关研究表明植物中广泛存在的黄酮类化合物具有良好的抗肿瘤作用，通过抑制肿瘤细胞增殖、阻碍新生血管形成和侵袭转移等是其主要的抗肿瘤作用方式。
　　目的:
　　本研究课题以甘草素(Liquiritigenin，LQ)为研究对象。有研究表明，甘草素具有解痉、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡的作用。有研究显示甘草素能够有效抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖和凋亡和甘草素能够抑制人结肠癌细胞系的生长。
　　本课题采用体外培养人舌癌Cal-27细胞，用不同浓度的甘草素作用不同时间，观察其抑制人舌癌Cal-27细胞的增殖及凋亡的影响，本实验引入在临床上广谱抗肿瘤药物顺铂(Cisplatin，CDDP)作为阳性对照组。通过对甘草素和顺铂抗肿瘤作用的研究证实天然植物中的黄酮类化合物-甘草素的抗肿瘤作用，并为黄酮类药物-甘草素治疗舌癌的临床应用提供科学的理论依据。
　　方法:
　　1、材料
　　Cal-27细胞:上海交通大学第九人民医院口腔颌面外科实验室提供。甘草素:上海原叶生物科技有限公司，纯度＞98％(HPLC)。顺铂:齐鲁制药有限公司生产。
　　2、方法
　　2.1 药液配置
　　甘草素用二甲基亚砜溶解后用DMEM培养液配置成25mmol/L存储液，使用前用DMEM培养液稀释成所需要的浓度。配置液4℃保存。
　　顺铂使用前用生理盐水配置成10μmol/L的溶液，避光放置，并根据需要稀释至所需浓度。配置液4℃保存。
　　2.2 细胞培养:将人舌癌Cal-27细胞置于采用加入10％胎牛血清和青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)的DMEM高糖培养液中，置于37℃、5％CO2饱和湿度恒温培养箱内培养，根据细胞贴壁情况，24～48小时传代1次，以0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA1∶1均匀混合传代培养。
　　2.3 MTT比色试验:取对数期生长的人舌癌Cal-27细胞制成1.0×105/L细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL培养基，培养24h。实验分三组:1、甘草素组(100、200、300、400、500μmol/L);2、顺铂组(1、2、4、6、8μmol/L);3、空白对照组加入等量的DMEM培养基处理人舌癌Cal-27细胞，分别处理24h、48h、72h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，再培养4h后吸弃上清液，而后每孔加入150μL的二甲基亚砜，使形成的结晶均匀溶解后，放置于562nm酶标仪上检测各浓度组的OD值，并计算细胞的生长抑制率。
　　2.4 应用倒置显微镜观察各浓度组细胞形态的变化:将人舌癌Cal-27细胞接种于培养皿中，于倒置显微镜下观察各实验组细胞（甘草素组、顺铂组）的形态变化，包括培养0h、24h、48h、72h细胞形态。
　　2.5 流式细胞术检测:分别检测甘草素组、顺铂组和空白组在处理24h、48、72h小时后，使用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法标记实验组、阳性对照组和空白对照组的活细胞，经流式细胞仪(FCM)检测，并对细胞凋亡情况进行分析。
　　3、统计学分析:
　　使用GRAPHPAD PRISM软件分析，应用方差分析和相关分析等对人舌癌Cal-27细胞的生长抑制率和凋亡情况进行统计分析。
　　结果:
　　1、甘草素组和顺铂组作用后均出现细胞形态改变。空白对照组细胞贴壁生长，呈多角形，质丰满，核居中。甘草素组:细胞核出现浓缩，细胞之间联系疏松，部分细胞变成圆形，多边形结构减少甚至消失。且随着用药浓度的增加核浓缩和细胞游离状态增加。顺铂组:细胞核出现浓缩，细胞之间连接中断，细胞大小形态不一致，多呈扁圆形，随着用药浓度的增加细胞浓缩程度、游离状态增加。
　　2、MTT比色实验:通过实验显示甘草素对人舌癌Cal-27细胞具有明显的抑制生长作用，24h最大生长抑制率可达48.06％，甘草素组(100、200、300、400、500μmol/L)人舌癌Cal-27细胞增殖抑制率随浓度增加而增加，同阳性对照顺铂组具有相同的趋势。统计学分析显示，不同甘草素药物浓度作用相同时间后的用药组处理人舌癌Cal-27细胞的生长抑制率不同(p＜0.05)，随着甘草素剂量的增加，细胞存活率具有剂量-效应关系。相同浓度不同时间的用药组处理人舌癌Cal-27细胞的生长抑制率也不同(p＜0.05)，随着甘草素作用时间的延长，细胞存活率具有时间-效应关系。
　　3、流式细胞术检测:空白对照组人舌癌Cal-27细胞存在凋亡，凋亡率较低;甘草素组(200、400μmol/L)与顺铂组(2、4μmol/L)对人舌癌Cal-27细胞作用后均存在明显细胞凋亡现象，实验组和阳性对照组的细胞凋亡率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增加;甘草素200μmol/L组细胞凋亡率与2μmol/L顺铂阳性对照组的凋亡率相近。经统计学分析，各浓度和时间之间具有统计学意义。
　　结论:
　　甘草素能够明显抑制人舌癌Cal-27细胞的增殖，并能够诱导细胞凋亡，并且呈现浓度和时间依赖性，有一定的剂量-效应关系。

目录

声明

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 细胞系

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂的配制

1．4 主要仪器

1．5 实验方法

1．6 统计学分析

2 结果

2．1 甘草素、顺铂对人舌癌Cal-27细胞生长、增殖的影响

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

致谢

硕士学习期间发表的论文