心肌梗死后心肌细胞内向整流钾通道重构以及缬沙坦干预机制的研究

摘要

尽管当代社会医疗水平不断进步，人们对健康生活方式的认识逐步加深，但心肌梗死（myocardial infarcion，MI）仍是临床上最常见的心血管疾病之一，是我国人民健康面临的重大威胁。我国每年约有54万人死于心脏性猝死，近九成猝死原因是急性MI后发生的恶性心律失常。以往的研究发现室性心律失常及心源性猝死与钾离子通道的重构有关。尤其是内向整流钾通道(the inward rectifierpotassium channel，Kir)，它是维持正常的动作电位的主要成分，维持静息膜电位，参与动作电位早期和终末复极化。在心肌细胞中最丰富的内向整流钾通道是IK1通道，心脏型为Kir2.1蛋白，被KCNJ2基因编码。MI后心室肌细胞电重构的主要特点之一是IK1电流密度的下降，导致室性心律失常的发生或易感性增加。尽管目前临床上已有多种抗心律失常药物的应用，但这些成熟的抗心律失常药物同时存在致心律失常作用，尤其是在QT间期延长者中应用。而MI后患者QT间期延长是提示恶性室性心律失常甚至猝死发生的重要指标。因此目前已知的抗心律失常药物在MI患者中的应用颇受局限。临床MI患者多数伴有高血压病等危险因素，而肾素—血管紧张素—醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)拮抗剂可以显著降低恶性心律失常的发生率，但具体机制尚未明确。因此，如能明确RAAS拮抗剂发挥抗心律失常作用的靶点，探明其作用机制，将对发现新的抗心律失常药物、改善MI预后具有重要意义。
　　第一部分 大鼠心肌梗死后内向整流钾通道重构以及缬沙坦的干预作用
　　目的：
　　明确急性MI后大鼠梗死灶周和非梗死左心室游离壁区心肌细胞中内向整流钾通道（Kir2.1蛋白）的表达水平，以及缬沙坦干预对该通道的效果。并且评价药物干预后大鼠心率、血压、室性心律失常易感性及血流动力学指标。
　　方法：
　　通过永久性结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性MI模型，评价造模情况。造模成功后随机分为假手术组（Control组）、假手术组+缬沙坦组(Control+Valsartan组)、心肌梗死组（MI组）、心肌梗死+缬沙坦组（MI+Valsartan组）。利用小动物遥测及尾动脉测压法记录大鼠术后心率、血压和心电图。7天后提取梗死灶周和非梗死左心室游离壁区心肌组织，利用qPCR和Westen blot法检测四组KCNJ2 mRNA水平和Kir2.1蛋白水平。
　　结果：
　　冠脉结扎术中心电监测和术后Masson's染色证明造模成功。MI后7天，MI组大鼠心率、血压均较Control组和Control+Valsartan组升高，而MI+Valsartan组有所下降。MI后延长的QTc和QTcd亦在缬沙坦干预后趋于正常。此外缬沙坦有效改善MI后心脏射血分数等血流动力学指标。同时，MI组中KCNJ2 mRNA和Kir2.1蛋白水平较Control组和Control+Valsartan组降低，而MI+Valsartan组中缬沙坦改善了该离子通道的重构。
　　结论：
　　大鼠MI后IK1通道表达水平显著降低，缬沙坦干预可逆转这一现象，同时伴随着心律失常易感性降低。而在正常大鼠心肌中，缬沙坦对IK1通道的调控作用并无显著统计学差异。
　　第二部分 缬沙坦改善心肌梗死后内向整流钾通道重构的机制研究
　　机制一:缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的NF-κB-miR-16信号通路调控内向整流钾电流
　　目的：
　　MicroRNAs是调控心律失常的重要因素之一。计算机预测microRNA-16(miR-16)可以靶向调控KCNJ2基因。NF-κB可以调控miR-16的启动子。本实验主要验证缬沙坦是否可以通过抑制MI后激活的NF-κB来下调miR-16的表达，且miR-16是否可以靶向调控KCNJ2基因的表达。
　　方法：
　　MI大鼠给予缬沙坦或生理盐水灌胃7天，提取梗死灶周心肌组织RNA和蛋白。体外培养H9c2心肌细胞和急性分离的新生大鼠心室肌细胞，转染miR-16或给予血管紧张素Ⅱ及缬沙坦干预。Western blot法检测NF-κB p65，inhibitorκBα（IκB∞和Kir2.1蛋白水平，qPCR检测KCNJ2 mRNA和miR-16表达水平。全细胞膜片钳记录IK1电流。荧光素酶检测验证KCNJ2是否为miR-16靶基因。CHIP验证NF-κB对miR-16的DNA结合水平。
　　结果：
　　梗死灶周miR-16表达水平升高，伴随KCNJ2/Kir2.1水平下降。体外转染miR-16使之过表达，导致KCNJ2/Kir2.1表达下调，伴随着IK1电流密度减低。相反的，抑制miR-16或导致其结合位点突变增强了KCNJ2/Kir2.1的表达。MI大鼠接受缬沙坦干预后，升高的NF-κB p65和miR-16水平下调，而降低的IκBα和Kir2.1蛋白水平升高。体外试验中，血管紧张素Ⅱ诱导的miR-16表达升高和KCNJ2/Kir2.1表达下降，同样被缬沙坦抑制。而体外经缬沙坦处理的细胞中过表达miR-16，可消除缬沙坦对KCNJ2/Kir2.1的保护作用。体内和体外实验均证明缺氧环境下NF-κB p65表达上调，而IκBα表达下降，缬沙坦干预抑制了这一现象。而抑制NF-κB后，缬沙坦和NF-κB抑制剂对miR-16和KCNJ2/Kir2.1的调节作用相似。CHIP进一步验证缬沙坦抑制NF-κB对miR-16的DNA结合水平。
　　结论：
　　MiR-16靶向调节KCNJ2基因的表达，MI后缬沙坦改善KCNJ2/Kir2.1的重构一定程度上依赖于NF-κB-miR-16信号通路。
　　机制二:缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的酪蛋白激酶2调控内向整流钾电流
　　目的：
　　MI后细胞内PKC等蛋白激酶对IK1的调节主要依赖于PIP2，并且其下游的调控机制鲜有报道。研究发现酪蛋白激酶2(CK2)结合并磷酸化编码Kir2.1蛋白的KCNJ2基因转录因子Spl。然而缬沙坦是否可以抑制MI后激活的CK2蛋白活性来影响KCNJ2基因表达以直接改善IK1通道重构还尚不明确。
　　方法：
　　MI大鼠给予缬沙坦或生理盐水灌胃7天，提取梗死灶周和非梗死左心室游离壁心肌组织RNA和蛋白。体外培养H9c2心肌细胞和急性分离的新生大鼠心室肌细胞，转染CK2或给予CoCl2、CK2抑制剂TBB及缬沙坦干预。Western blot法检测CK2和Kir2.1蛋白水平，qPCR检测CK2 mRNA和KCNJ2 mRNA表达水平。全细胞膜片钳记录IK1电流。EMSA检测体内及体外Sp1的DNA结合活性。
　　结果：
　　梗死灶周和非梗死左心室游离壁区心肌组织CK2蛋白表达升高，Kir2.1蛋白表达下降，伴随着IK1电流密度减低，同时伴随二者mRNA水平的变化。缬沙坦干预后逆转了这一现象。体外培养的H9c2细胞中过表达CK2蛋白抑制了KCNJ2/Kir2.1的表达。相反的，抑制CK2蛋白可以增加KCNJ2/Kir2.1的表达。同样的，在体外诱导缺氧环境中，缬沙坦同样抑制缺氧后升高的CK2蛋白水平。体外经缬沙坦处理的细胞中过表达CK2，可消除缬沙坦对KCNJ2/Kir2.1的保护作用。EMSA检测证明CK2抑制Sp1的DNA结合活性，TBB抑制CK2后，Sp1的DNA结合活性升高。而MI后大鼠心肌组织中Sp1的DNA结合活性下降，缬沙坦干预后其活性上升。
　　结论：
　　AT1受体拮抗剂缬沙坦抑制CK2蛋白活性，增加Kir2.1蛋白表达，从而改善MI后IK1通道重构。
　　机制三:缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的Ⅰ型辅助性T细胞免疫反应调控内向整流钾电流
　　目的：
　　MI导致Kir2.1蛋白介导的IK1电流密度减低，伴随着T细胞水平上调。细胞因子IFN-γ主要Th1细胞分泌。小胶质细胞中IFN-γ导致IK1电流密度下降。本实验主要验证MI后Th1细胞是否可以通过其分泌的细胞因子介导IK1通道重构，以及缬沙坦是否可以改善这一现象。
　　方法：
　　空白对照大鼠和MI大鼠给予缬沙坦或生理盐水灌胃7天，提取梗死灶周心肌组织RNA和蛋白。体外培养急性分离的梗死灶周大鼠心室肌细胞和新生大鼠心室肌细胞，分别给予缬沙坦干预和与分离的淋巴细胞共培养。流式细胞术分析大鼠心肌组织中Th1细胞数目。Elisa法检测大鼠血浆中IFN-γ、IL-2和TNF-α水平。Western blot法检测Kir2.1蛋白水平，qPCR检测T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-10的mRNA表达水平。全细胞膜片钳记录IK1电流。
　　结果：
　　MI后Th1细胞数目及其分泌的细胞因子水平升高，Kir2.1蛋白水平下降。而MI大鼠缬沙坦干预后，Th1细胞数及其细胞因子水平下降，同时Kir2.1蛋白表达及IK1电流密度升高。在体外淋巴细胞与心肌细胞共培养后，缬沙坦干预对Kir2.1/IK1的调控同上。在体外培养的新生大鼠心室肌细胞中，IFN-γ干预可抑制IK1电流密度，而IL-2和TNF-α对该通道无明显作用。
　　结论：
　　缬沙坦可以通过抑制MI后激活的Th1免疫反应、减低IFN-γ水平，来改善IK1通道的重构。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 大鼠心肌梗死后内向整流钾通道重构以及缬沙坦的干预作用

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 缬沙坦改善心肌梗死后内向整流钾通道重构的机制研究

机制一：缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的NF-κB-miR-16信号通路调控内向整流钾电流

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

机制二：缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的酪蛋白激酶2调控内向整流钾电流

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

机制三：缬沙坦通过抑制心肌梗死后激活的Ⅰ型辅助性T细胞免疫反应调控内向整流钾电流

前言

试验材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

创新性及局限性

外文论文-1

外文论文-2

外文论文-3

致谢

攻读学位期间的科研成果