脑源性神经营养因子在结肠粘膜屏障中的作用研究

摘要

背景：
　　脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为神经营养因子家族的重要成员之一，在中枢神经系统的生长、发育及功能维持中发挥重要作用。研究发现，除神经系统外，许多外周组织亦可合成和分泌神经营养因子BDNF，比如肠粘膜上皮细胞、血管内皮细胞以及牙周组织。一些研究表明，周围神经细胞分泌多种可溶性因子如BDNF、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、胶质源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)，这些因子在维持血神经屏障的完整性或者通透性以及调控紧密连接因子上发挥着重要作用;在胎儿发育过程中，血管内皮细胞合成并分泌的BDNF因子，通过其高亲和力受体酪氨酸激酶B(tyrosinekinase B，TrkB)，发挥调节血管内皮屏障的功能;细胞实验中，在炎症因子刺激下，人微血管内皮细胞分泌较多BDNF因子，BDNF通过促进血管内皮钙黏着蛋白的表达来抑制血管内皮屏障功能的失调。钙黏着蛋白是细胞间连接蛋白的重要成员之一，在调控内皮细胞屏障的通透性中发挥着至关重要的作用。在消化系统中，神经营养因子家族的成员NGF与神经营养因子-3（neurotrophins-3，NT-3）均参与肠道屏障功能的调控。已有研究表明BDNF在结肠粘膜中表达丰富，然而BDNF是否参与调控肠上皮屏障功能目前尚未见文献报道。
　　目的：
　　1.运用基因敲除小鼠模型探讨BDNF在结肠上皮屏障的生理作用;
　　2.运用基因敲除小鼠模型探讨BDNF对结肠上皮细胞凋亡以及紧密连接蛋白(tight junction proteins，TJs)的影响;研究参与BDNF+/-小鼠结肠上皮细胞凋亡的相关因子;
　　3.应用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调结肠上皮细胞ht-29中BDNF的表达并研究其对TJs的影响。
　　4.探讨BDNF因子对ht-29结肠上皮细胞TJs的直接影响。
　　方法：
　　1.动物试验
　　取健康野生型C57Bl/6小鼠（BDNF+/+）与基因敲除BDNF+/-小鼠结肠粘膜标本，运用尤斯灌流技术检测结肠粘膜电阻值(transepithelial resistance，TER)，评估结肠粘膜完整性;用苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色以及透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)观察结肠粘膜上皮的结构;利用末端标记法（TUNEL）染色、active-caspase-3染色以及免疫印迹法测定active-caspase-3、bcl-2和bax含量评估凋亡情况;利用免疫组化技术检测TJs(occludin与ZO-1)在结肠粘膜的表达与分布，利用免疫印迹法测定TJs（claudin-1与claudin-2）在结肠粘膜的表达。
　　2.细胞试验
　　以人结肠上皮细胞系ht-29为研究对象，设计合成针对BDNF的小干扰RNA，将BDNF-siRNA转染入结肠上皮细胞作为实验组，无活性的siRNA转染作为对照组，实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹法检测各组结肠上皮细胞中BDNF和TJs(occludin、ZO-1、claudin-2和claudin-1)基因与蛋白表达水平的变化。
　　为了研究BDNF在结肠上皮细胞的直接作用，分别用1ng/ml、10ng/ml、100ng/mlBDNF刺激细胞，选取2h、6h、12h、24h获取细胞后，应用实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹法检测各实验组结肠上皮细胞TJs（occludin、ZO-1、claudin-2和claudin-1）基因与蛋白表达的变化。
　　3.统计学分析
　　统计学处理采用SPSS20.0软件，计量资料以均值±标准误表示。两组之间的比较的比较均采用独立样本t检验方法;对于BDNF因子对结肠上皮细胞TJs基因与蛋白的影响，采用单因素方差的Dunnett't分析。P值小于0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.动物试验
　　与BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠结肠上皮屏障破坏，结肠粘膜超微结构异常，表现为微绒毛缺失、线粒体肿胀、细胞间隙增宽、细胞凋亡增加以及细菌入侵;TUNEL阳性结肠上皮细胞增多以及caspase活性升高证明了BDNF+/-小鼠结肠粘膜中上皮细胞凋亡明显增多，并且过多的凋亡细胞与BDNF+/-小鼠结肠上皮屏障功能改变存在一定的关联。除此之外，BDNF+/-小鼠结肠粘膜抑制凋亡bcl-2蛋白表达下调，而促凋亡bax蛋白表达上调。另外，BDNF+/-小鼠结肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及claudin-1表达下调，而claudin-2表达上调。
　　2.细胞试验
　　向结肠上皮细胞ht-29转染siRNA后可以显著降低BDNF基因与蛋白表达，同时也下调紧密连接蛋白的表达。利用不同浓度的BDNF因子刺激ht-29细胞，可导致紧密连接蛋白（occludin，ZO-1与claudin-1）表达下调，而紧密连接蛋白claudin-2表达上调。
　　结论：
　　1.与BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠结肠上皮屏障破坏伴随着紧密连接蛋白异常以及细胞凋亡增多。
　　2.通过上调或者下调结肠上皮细胞中BDNF因子的含量，其紧密连接蛋白表达发生相应的改变。
　　3.BDNF通过抑制细胞凋亡以及调节紧密连接蛋白的表达来维持肠道上皮的屏障功能。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1．实验动物与分组

2．实验仪器与材料

3．实验试剂

4．方法

5 统计学方法

结果

1．BDNF+／+小鼠和BDNF+／-小鼠结肠粘膜BDNF表达水平的差异

2．BDNF+／+小鼠和BDNF+／-小鼠结肠粘膜电阻值的差异

3．BDNF+／+小鼠和BDNF+／-小鼠结肠粘膜上皮组织学与超微结构差异

4．BDNF+／-小鼠IECs凋亡增多以及凋亡相关蛋白表达异常

5．BDNF+／-小鼠结肠上皮紧密连接蛋白表达异常

6．BDNF-siRNA对结肠上皮细胞TJs和BDNF的表达影响

7．BDNF因子直接作用于结肠上皮细胞对TJs的影响

讨论

(一)BDNF通过抑制IECs凋亡来调控结肠上皮屏障的功能

(二)BDNF通过调节TJs的表达来调控结肠上皮屏障功能

(三)BDNF通过其他通路来调控结肠上皮屏障功能

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表