绿色荧光蛋白eCGP123在冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus中应用及herA-nurA同系物基因必需性研究

摘要

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为基因表达和蛋白定位的荧光标记物，主要应用于真核生物和细菌细胞和分子生物学研究中。大多数古菌生活在恶劣的环境中。其中，冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus的最适生活条件是75-80℃、pH2-3。大多数GFP因高温强酸条件下易失活变性而无法应用于S.islandicus中。在许多GFP突变体中，eCGP123(enhanced consensus green proteinvariant123)具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等性质，已经用于研究S.acidocaldarius细胞表面不同Ⅳ型菌毛结构缺失突变体对细胞膜形成的影响。但是，eCGP123能否应用于古菌蛋白的细胞定位中，这个问题还有待解决。
　　ATPase/解旋酶HerA(SiRe_0064)和核酸酶NurA(SiRe_0061)是参与S.islandicus中DNA双链断裂（double-stranded breaks，DSBs）修复的重要蛋白，能够对dsDNA进行切割，与Mre11-Rad50复合物协同作用，最后产生3'-overhang底物。She等人以及实验室尝试敲除S.islandicus同一个操纵子中的mre11、rad50、herA和nurA这四个基因，但都没有得到缺失突变体，说明它们对细胞的生存是必需的。除了经典的herA-nurA基因外，S.islandicus基因组中还存在多个herA-nurA同系物基因。其中，herA同系物基因包括SiRe_0017、SiRe_0095、SiRe_0566、SiRe_0581和SiRe_1531; nurA同系物基因包括SiRe_0014、SiRe_0094、SiRe_0565、SiRe_0582和SiRe_1533。这些基因总是成对出现，目前尚不清楚它们在体内的必需性和功能。
　　本研究中，为了研究eCGP123在S.islandicus活细胞中作为报告基因对蛋白进行细胞定位的可行性以及herA-nurA同系物基因必需性，利用S.islandicus中比较完善的遗传操作体系，构建eCGP123融合蛋白过表达菌株和herA-nurA同系物基因敲除菌株，测定菌株生长曲线，分析细胞表型以及显微观察进行蛋白的细胞定位等实验。
　　首先，优化与合成了eCGP123基因。在E.coli中，表达和纯化得到eCGP123,它具有较高的热稳定性，表达细胞均产生绿色荧光。同时，在S.islandicus中表达了eCGP123及其融合蛋白eCGP123-lacS，表明eCGP123具有较高的热稳定性和耐酸性，为S.islandicus中蛋白的细胞定位奠定了基础。
　　随后，在eCGP123的C-末端分别融合了E.coli和S.islandicus中的功能蛋白，研究其在蛋白细胞定位中的可行性。在E.coli中，通过eCGP123对微管同源蛋白FtsZ进行定位，观察到eCGP123-FtsZ的荧光主要分布在细胞的中间，达到了预期结果。eCGP123在S.islandicus中单独表达时，荧光均匀分布于细胞中;与定位于细胞膜上的分泌型ATP酶UpsE融合后，荧光也呈均匀分布，但难以判断其定位。当eCGP123与PCNA亚基PCNA1融合时，可以在少数细胞中观察到1-4个PCNA1 foci。本底表达的SiRe1200-C-His能够通过eCGP123定位于细胞中间，进一步表明其参与细胞分裂。能够观察到eCGP123-SiRe_1388-no-His的荧光分布在细胞中间并环绕在细胞周围，因此，SiRe_1388可能参与细胞的分裂，定位于细胞膜上。eCGP123-SiRe_1550的荧光集中在细胞的某一个区域，无法判断其定位。通过细胞表型分析和生长曲线测定，发现，eCGP123影响了SiRe_1200、SiRe_1388和SiRe_1550等蛋白过表达细胞的生长，出现大细胞。总体而言，在S.islandicus中，eCGP123具有一定的蛋白定位功能，但其荧光较弱，易淬灭，融合蛋白的过表达可能会影响细胞的生长，而且蛋白的定位受到融合蛋白表达水平的干扰，再加上细胞直径较小(直径1-2μm)，因此，对蛋白的定位造成一定的困难。
　　另一方面，采用等位置换的敲除策略，尝试对位置上较近的herA-nurA同系物基因进行双敲，分析了它们的必需性。通过MCSV平板筛选，只得到SiRe_0014-SiRe_0017、SiRe_0094-SiRe_0095、SiRe_0581-SiRe_0582和SiRe_1531-SiRe_1533等双敲除菌株，而且它们在细胞生长和形态上与对照菌株没有明显的差异，说明它们是非必需基因。但是，没有得到△SiRe_0565-SiRe_0566敲除菌株，暗示了SiRe_0565-SiRe_0566基因对细胞生长的重要性，很可能是必需基因。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 古菌概述

1．2 硫化叶菌概述

1．3 古菌遗传操作系统

1．3．1 冰岛硫化叶菌过表达系统

1．3．2 冰岛硫化叶菌基因敲除系统

1．4 绿色荧光蛋白

1．4．1 绿色荧光蛋白概述

1．4．2 eCGP123概述

1．5 古菌同源重组修复蛋白HerA、NurA及其同系物

1．5．1 DNA的损伤及其修复

1．5．2 古菌同源重组修复蛋白HerA与NurA

1．5．3 HerA-NurA同系物

1．6 研究目的和意义

第二章 eCGP123基因的优化、蛋白表达与性质鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 eCGP123基因的优化与合成

2．1．3 eCGP123表达质粒的构建

2．1．4 大肠杆菌DH5α和BL21-codonPlus(DE3)-RIL感受态细胞的制备

2．1．5 冰岛硫化叶菌感受态细胞的制备

2．1．6 大肠杆菌和冰岛硫化叶菌中表达质粒的转化及过表达菌株的筛选和鉴定

2．1．7 目的蛋白的表达、纯化与分析

2．1．8 eCGP123热稳定性、聚集性和吸光值分析

2．1．9 eCGP123在大肠杆菌和冰岛硫化叶菌细胞中的荧光观察

2．1．10 eCGP123过表达对冰岛硫化叶菌细胞生长的影响

2．2 结果与分析

2．2．1 eCGP123基因的优化与合成

2．2．2 eCGP123表达质粒的构建

2．2．3 eCGP123在大肠杆菌中的表达、纯化与性质鉴定

2．2．4 eCGP123在冰岛硫化叶菌中的过表达、荧光检测和菌株的生长曲线测定

2．3 本章小结

第三章 eCGP123在冰岛硫化叶菌蛋白定位中的初步研究与应用

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 eCGP123融合蛋白表达质粒的构建

3．1．3 大肠杆菌和冰岛硫化叶菌中过表达质粒的转化及过表达菌株的筛选和鉴定

3．1．4 eCGP123融合蛋白的表达、纯化与分析

3．1．5 eCGP123融合蛋白在大肠杆菌和冰岛硫化叶茵细胞中的荧光定位

3．1．6 eCGP123融合蛋白过表达对冰岛硫化叶菌细胞生长的影响

3．2 结果与分析

3．2．1 eCGP123融合蛋白表达质粒的构建

3．2．2 eCGP123-FtsZ在大肠杆菌中的表达、纯化和分析

3．2．3 eCGP123融合蛋白在冰岛硫化叶菌中的表达与鉴定

3．2．4 eCGP123融合蛋白在冰岛硫化叶菌细胞中的荧光定位

3．2．5 eCGP123融合蛋白过表达对冰岛硫化叶菌细胞生长的影响

3．3 本章小结

第四章 冰岛硫化叶菌中herA-nurA同系物基因的敲除及必需性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 herA-nurA同系物基因敲除载体的构建

4．1．3 冰岛硫化叶菌中敲除载体的电转化和敲除菌株的筛选

4．1．4 冰岛硫化叶菌基因组DNA的提取

4．1．5 herA-nurA同系物基因敲除菌株的鉴定

4．1．6 herA-nurA同系物基因敲除对冰岛硫化叶菌细胞生长的影响

4．2 结果与讨论

4．2．1 herA-nurA同系物基因敲除设计

4．2．2 herA-nurA同系物基因敲除载体的构建

4．2．3 herA-nurA同系物基因敲除菌株的筛选和鉴定

4．2．4 herA-nurA同系物基因敲除对冰岛硫化叶菌细胞生长的影响

4．3 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

附录

参考文献

致谢