冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus新型ATPase的结构与功能研究

摘要

古菌是与细菌和真核生物并列的第三域生命形式，其细胞结构和代谢方式与细菌类似但遗传信息加工传递机制，包括DNA复制、转录、重组、修复和蛋白翻译，更接近于真核生物。硫化叶菌是典型的超嗜热泉古菌，生活于高温及酸性极端环境，但其基因组保持稳定，自发突变率并不高，暗示其细胞内有一套完善的DNA修复系统。根据已有的报道，在硫化叶菌细胞中存在的DNA修复途径包括同源重组修复，核酸切除修复和碱基切除修复。与细菌相比，参与这些修复途径的蛋白也更接近于真核生物。
　　DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)是细胞内最严重的DNA损伤形式之一。同源重组修复和非同源末端链接是修复DSBs的两种重要途径。目前，在绝大多数古菌中只发现了同源重组修复途径，对参与该途径的保守蛋白Mre11，Rad50和重组酶RadA(真核生物中为Rad51)都有深入的研究。除此之外，对古菌中参与同源重组修复的其他蛋白也有较多的报道，包括NurA，HerA，Hjc和Hje等。Holliday junction(HJ)是同源重组过程中的标志性中间产物，HJ需要被及时的处理以保证顺利地完成DNA修复和和色体的正常分离。细胞内处理HJ的方式主要有两种，一种是由HJ解离酶介导的“resolution”，典型的HJ解离酶包括RuvC，Hjc，Yen1/GEN1和Slx1-Slx4/SLX1-SLX4;另一种是由解旋酶、拓扑异构酶及其他蛋白组成的复合体介导的“ dissolution”。在细菌中已经报道参与“ resolution”过程的蛋白是RuvAB复合物。到目前为止，在古菌和真核生物中还没有鉴有到经典的类似于RuvAB的蛋白复合物。
　　在本研究中，我们在超嗜热古菌冰岛硫化叶菌S.islandicus细胞中表达了羧基端带有组有组酸标签的解离酶Hjc(基因组中其编码基因为SiRe_1431)，通过亲和纯化和质谱鉴定发现了与Hjc在基因基上位置相邻并可能与Hjc存在相互作用的一个蛋白，SiRe_1432。对氨基酸序列分析发现， SiRe_1432包含典型的PIN结构域和P-loopATPase结构域，因此将SiRe_1432命名为SisPINA(冰岛硫化叶菌来源的PIN domain-containing P-loop ATPase)。进一步，我们通过Pull-down实验确认了SisPINA与Hjc具有物理相互作用，暗示着SisPINA与Hjc可能在细胞内共同参与HJ的处理。
　　为了探索SisPINA在冰岛硫化叶菌S.islandicus中的功能，我们尝试敲除细胞内染色体上SisPINA的编码基因，尝试多次后始终无法获得敲除SisPINA基因的缺失突变体菌株，暗示着SisPINA可能是一个不可敲除的基因。利用遗传回补实验我们确认了SisPINA是S.islandicus细胞正常生长所必须的基因。
　　接下来，我们鉴定了SisPINA的基本生化性质。首先，构建了表达野生型和四个不同点突变体的载体;然后，在E.coii中进行异源表达后并对目的蛋白进行了纯化。最后，我们鉴定了SisPINA的ATP水解活性、DNA结合活性和HJ链迁移活性。ATP水解实验表明SisPINA具有明显的ATP水解能力，不同的DNA底物对其ATPase活性无明显的影响。凝胶阻滞实验表明SisPINA能够结合不同类型的DNA底物，包括单链DNA、钝端双链DNA、5’-overhang DNA、 Y形DNA、复制叉DNA和HJ DNA，但是结合复制叉DNA和HJ DNA的能力明显强于其他DNA底物。进一步，我们发现SisPINA能催化HJ DNA发生链迁移，生成Y形的迁移产物，并能够继续解链Y形DNA产生单链DNA。同时，我们确认了SisPINA的链迁移活性依赖其ATPase活性。
　　为了进一步研究SisPINA在细胞内的生物学功能，我们鉴定了与SisPINA相互作用的蛋白并分析了蛋白之间的相互作用。实验结果表明， SisPINA与 Hjc具有功能上的相互作用，SisPINA能够明显增强Hjc切割不可动HJDNA的解离酶活性，同时，Njc切割可动HJ DNA的链的偏好性也受到SisPINA的调节，但Hjc对SisPINA的HJ链迁移活性则有明显的抑制作用。除了与Hjc有相互作用，SisPINA和RFCs及Hjm都能分别形成稳定的复合物。Pull-down实验进一步确认了SisPINA的羧基端区域介导了SisPINA与Nc，RFCs和Hjm的相互作用。
　　最后，为了从原子水平上揭示SisPINA的作用机理，我们解析了SisPINA两个突变体的晶体结构。SisPINAK261A的晶体结构显示，一个SisPINA的晶胞中包含有6个SisPINA蛋白分子，SisPINA可形成稳定的环形六聚体，该结果与SisPINA在溶液中也形成六聚体的结果一致。进一步分析组成SisPINA六聚体的亚基，我们发现六个亚基处于两种不同的构象，其中亚基A(B，C和E)为未结合AT结的构象，亚基D（F)为结合ATP的构象。通过ATP的结合和水解引起SisPINA构象的变化，从而推动HJ发生链迁移。 SisPINAR147KI199SR206A的晶体结构显示，SisPINA的羧基端可折叠形成一个KH结构域(hnRNPKhomology结构域)，在SisPINAK261A的晶体结构中由于电子密度缺失并未观察到该区域的晶体结构。有意思的是在该突变体的晶胞中只包含有一个SisPINAR147KI199SR206A蛋白分子，这种突变导致SisPINA发生解聚的分子机理还需要进一步的研究。根据SisPINA和Hjc的晶体结构，以及SisPINA与Hjc功能上的相互作用，我们构建了SisPINA和Hjc共同处理HJDNA的结构模型，该模型为揭示古菌中Holliday junction的处理机制提供了新的视角。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．1．1 古菌的概述

1．1．2 古菌的分类

1．1．3 硫化叶菌概述

1．2 DNA双链断裂的修复

1．2．1 非同源末端链接

1．2．2 同源重组修复

1．2．3 古菌中的同源重组修复

1．3 Holliday Junction解离酶

1．3．1 HoHiday Junction模型

1．3．2 HJ解离酶简介

1．3．3 细菌中的HJ解离酶

1．3．4 古菌中的HJ解离酶

1．3．5 真核生物的HJ解离酶

1．4 HJ链迁移蛋白

1．5 PIN结构域蛋白简介

1．6 AAA+蛋白简介

1．7 KH结构域简介

1．8 本论文的研究目的和内容

1．8．1 本论文的研究目的

1．8．2 本论文的研究内容

第二章 SisPINA的生物信息学和遗传学分析

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 培养基与其他材料

2．2 实验方法

2．2．1 敲除质粒pMID—SisPINA的构建

2．2．2 敲除质粒pMID—SisPINA的电转化

2．2．3 SisPINA整合型菌株的筛选与鉴定

2．2．6 pSSRlacS-A-SisPINA遗传回补菌株的构建

2．2．7 系统进化树的构建

2．3 实验结果

2．3．1 Hjc相互作用蛋白的鉴定

2．3．2 SisPINA的生物信息学分析

2．3．3 SisPINA编码基因的敲除

2．3．4 SisPlNA的遗传回补分析

2．4 本章小结

第三章 Si sPINA的生化性质分析

3．1 实验材料

3．2．1 SisPINA表达载体的构建

3．2．2 SisPINA定点突变体表达载体的构建

3．2．3 SisHjc表达载体的构建

3．2．4 SisPINA和SisHjc共表达载体的构建

3．2．6 SisPINA及其突变体蛋自的纯化

3．2．8 SisPINA(氨基端带6×组氨酸标签)和SisHjc(无标签)的共纯化

3．2．9 DNA底物的制备与纯化

3．2．1 0 ATPase活性检测

3．2．1 1凝胶阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)实验

3．2．1 3 Western-blot

3．2．1 4 Pull-down

3．3 实验结果

3．3．2 SisPlNA与SisHjc具有物理相互作用

3．3．3 SisPINA的ATPase活性

3．3．4 SisPINA的DNA结合活性

3．3．5 SisPlNA的解旋酶活性

3．4 本章小结

第四章 SisPINA与Hjc互作的功能分析及其与其它互作蛋白的鉴定

4．1 实验材料

4．2．2 Hje,SisPINAΔC，Hjm和RFCs的表达和纯化

4．2．3 冰岛硫纯叶菌SisPINA基因氨基端带6×组氨酸标签菌株的构建与蛋白纯化

4．2．4 潜在的与SisPINA相互作用的蛋白的鉴定

4．2．5 Pull-down实验

4．2．6 分子筛实验

4．2．7 Hjc核酸内切酶活性检测

4．3 实验结果

4．3．2 SisPINA对SisHjc的HJ切割活性的影响

4．3．3 SisHjcE12A对SisPlNA的HJ解旋活性的影响

4．3．4 氨基端6×组氨酸标签的SisPINA的纯化

4．3．5 潜在的与SisPINA相互作用蛋白的鉴定

4．3．6 SisPINA和RFCs具有物理相互作用

4．3．7 SisPINA和Hjm具有物理相互作用

4．3．8 SisPINA的羧基端是SisPiNA与RFCs和Hjm相互作用的区域

4．3．9 RFCs抑制SisPINA的HJ解旋活性

4．3．10 SisPINA对Hjm解旋酶活性的影响

4．4 本章小结

第五章 SisPINA的晶体学研究

5．1 实验材料

5．1．1 菌株与质粒

5．1．2 培养基

5．1．3 主要试剂和仪器

5．2 实验方法

5．2．2 目的蛋白的表达

5．2．3 硒代甲硫氨酸蛋白的表达

5．2．4 目的蛋白的纯化

5．2．5 硒代甲硫氨酸蛋白的纯化

5．2．6 蛋白结晶条件的筛选

5．2．7 蛋白晶体的优化

5．3．1 重组蛋白的纯化

5．3．2 蛋白结晶条件

5．3．3 蛋白晶体的优化

5．3．4 蛋白晶体衍射数据的收集

5．3．5 蛋白晶体结构的解析

5．3．6 SisPINA-PIN的晶体结构

5．3．7 SisPINAK261A的晶体结构

5．3．8 SisPINAR206ARl47K1199S的晶体结构

5．3．9 其他蛋白的晶体结构解析

5．4 本章小结

第六章 总结与讨论

附录

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文