GPR124在糖尿病肾病足细胞损伤中的保护作用

摘要

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的微血管病变之一，并且是导致终末期肾病的主要因素。肾小球足细胞是一种高度分化、具有独特结构和功能的上皮细胞，是构成肾小球滤过屏障的关键组成部分。研究表明足细胞损伤是糖尿病肾病重要的细胞事件，是导致肾脏损伤的起始因素。多种因素参与了糖尿病肾病足细胞损伤，包括氧化应激、高血糖、脂质代谢紊乱及炎性反应等，然而针对目前机制所采取的治疗措施均未能阻滞糖尿病肾病的发展进程，因此进一步明确糖尿病肾病足细胞损伤的的发病机制并寻找新的药物靶点是目前亟待解决的问题。
　　G蛋白偶联受体(G-protein Coupled Receptor，GPCR)是目前发现最大的一类受体超家族，其成员超过1000个。GPCR在多种重要的生理功能中扮演重要角色，这包括视觉、味觉、嗅觉、情绪的调控、免疫系统的激活和肿瘤的生长等。根据氨基酸序列的同源性和功能差异GPCR可分为以下五大亚家族:GlutamateGPCRs, Rhodopsin GPCRs, Adhesion GPCRs, Frizzled/Taste2 GPCRs, SecretinGPCRs。GPCR是最重要的药物靶点，其功能研究一直是生物学与药物研发的研究热点。近年来，越来越多的研究表明多种GPCR在糖尿病肾病发病过程中起到关键作用，如血管紧张素Ⅱ受体(ATR)、前列腺素E2(PGE2)受体(EP)、内皮素-1(ET-1)受体(ETAR)及腺苷受体(A2R)等，而相应的EP阻滞药、血管紧张素转化酶抑制剂、ETAR拮抗剂等均能够延缓糖尿病肾病的进展，因此作用于GPCR的药物已经成为糖尿病肾病的重要治疗策略。
　　GPR124是一种孤儿受体，从属于Adhesion GPCRs亚家族。GPR124包含1331个氨基酸的开放阅读框，其中仅胞外N末端区域就占有760个氨基酸。主要结构包含GPS，HormR，Ig，LRRCT， PDZ，RGD，7TM。目前关于GPR124的研究大多报道了其在大脑中枢神经系统的功能。文献报道Gpr124的缺失扰乱了TGF-β通路的激活过程，并且出现了血管内皮组织中大量VEGF指示基因表达上调;内皮中GPR124调节血管生成，迁移和血脑屏障标记蛋白Glut1的生成，并且推测Glut1可能为GPR124下游位点;另外，GPR124可作为Wnt7特异性共激活子，在其诱导的经典β-catenin通路中起着关键的作用。以上的这些因子均在DN的发生发展中起着重要作用。这些实验研究提示我们GPR124或许参与到糖尿病肾病的发生发展。
　　目的:
　　1.研究GPR124在糖尿病肾病足细胞损伤中的变化及作用。
　　2.检测GPR124在其它足细胞疾病中的表达变化，明确GPR124是否是足细胞病的共有靶标。
　　方法及结果:
　　首先对GPR124在小鼠主要器官，肾脏各细胞及在不同种属间的表达情况进行了表征。然后，本文用Western blot，Real time RT-PCR及免疫组织化学的方法证明了在链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）诱导的糖尿肾病模型中GPR124表达下调。在体外实验中，本文用高糖（High Glucose，HG）、糖基化终末期产物(Advanced Glycation End Products，AGE)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)等体外肾脏疾病环境下，培养足细胞同样发现GPR124表达下调。通过Cre-LoxP系统建立了足细胞特异性敲除的小鼠模型，通过扩增基因产物片段大小的差异来筛选出纯合子，并且用免疫荧光的方法证明了模型建立成功。然后我们建立了STZ诱导的DN模型，通过PAS染色发现足细胞特异性敲除GPR124能够加重肾损伤。为进一步明确机制，我们构建了过表达GPR124的腺病毒载体，发现GPR124过表达后，在HG状态下足细胞的自噬水平增强。进一步发现GPR124过表达在HG状态下可下调YAP的表达及磷酸化水平，这提示我们GPR124参与到Hippo通路转导中。最后，为表明GPR124的表达变化与其它足细胞疾病的关系，我们通过免疫组化的方式检测了足细胞疾病中GPR124的表达情况，同时我们构建了ADR诱导的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)模型，Westernblot及Real time RT-PCR的结果显示GPR124在FSGS小鼠肾脏组织中表达降低。与体内结果一致，体外培养的足细胞在ADR的刺激下，GPR124的表达下调。
　　结论:
　　1.GPR124在DN，FSGS等足细胞疾病中表达明显下调，足细胞特异性敲除GPR124加重STZ诱导的肾脏损伤，以上结果表明GPR124的表达调控参与到了足细胞疾病发生过程，其表达下调是导致足细胞损伤的重要因素。
　　2.GPR124过表达可通过下调YAP表达水平增强自噬功能，进一步发挥对足细胞及肾脏的保护作用，这一结果提示GPR124是YAP-Autophagy信号通路的关键组成部分。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验材料

一、实验样本

二、药品与试剂

三、药品及试剂配制方法

四、实验器材

实验方法

一、动物模型

二、细胞实验

三、统计学处理

四、具体操作步骤

第一部分：GPR124在糖尿病肾病模型中的表达变化及作用

一、实验结果

二、讨论

三、结论

第二部分：GPR124在其他足细胞疾病中的表达变化

一、实验结果

二、讨论

三、结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参与发表的论文、著作

学位论文评阅及答辩情况表