粒细胞集落刺激因子通过促进肾脏分泌EPO刺激小鼠脾红细胞生成作用的研究

摘要

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是体内重要的细胞因子，能促进粒细胞生成和增强粒细胞活性，临床上用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症和动员造血干/祖细胞用于造血干/祖细胞移植。近期有文献研究提示G-CSF可促进肿瘤转移和加重肿瘤患者贫血症状;G-CSF动员造血干细胞之后，会造成健康捐献者造血干细胞长时间基因表达异常;长时间使用G-CSF治疗先天性粒细胞减少症可增加患白血病的概率;而我们在前期实验中发现，分泌G-CSF的乳腺癌细胞可造成小鼠红细胞生成系统紊乱，骨髓红细胞生成受到抑制，脾红细胞生成功能增强。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是红细胞生成的关键细胞因子，机体内的EPO主要是由肾小管间质细胞分泌。G-CSF是否可通过改变机体EPO水平影响造血系统，目前尚缺乏有效的文献支持。研究G-CSF诱导红细胞生成系统功能紊乱的机制，从不同角度评价G-CSF对机体的作用，可使我们更好的理解G-CSF的药理活性和不良反应，并有助于进一步阐明G-CSF与肿瘤的发生发展的关系，为G-CSF临床合理用药和肿瘤治疗提供重要参考;同时可拓展我们对脾脏功能的认识，有利于深入理解机体红细胞生成系统的调控机制。
　　目的:
　　研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导脾脏红细胞生成的作用机制，分析EPO在脾红细胞生成中的功能，评价肾脏功能对脾红细胞生成能力的影响。
　　方法:
　　1.给予C57BL/6J小鼠皮下注射粒细胞集落刺激因子G-CSF，后采用FITC RatAnti-Mouse Ter119(或APC Rat Anti-Mouse Ter119)和PE Rat Anti-MouseCD71双参数标记，流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞和脾细胞中Ter119和CD71双阳性(CD71+Ter119+)细胞群体所占比例。
　　2.给予小鼠皮下注射G-CSF，采用APC Rat Anti-Mouse Ter119和Thiazoleorange双参数标记，流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞和脾脏细胞中网织红细胞(Ter119+Thiazole orange+)和有核红细胞(原红细胞和幼红细胞，Ter119+Thiazole orange++)占总细胞比例。
　　3.给予小鼠皮下注射G-CSF，对小鼠骨髓与外周血进行细胞涂片，采用Wright-Giemsa染色，显微镜下观察。
　　4.给予皮下注射G-CSF，取小鼠脾脏细胞原代培养CFU-E(Colony FormingUnits-erythrocyte)，显微镜下观察CFU-E集落形成情况。
　　5.为探究G-CSF诱导的脾脏红细胞生成作用是否与EPO有关，给予小鼠皮下注射G-CSF，心脏取血，离心取血清，采用ELISA方法检测小鼠血清中EPO的浓度。
　　6.给予小鼠皮下注射G-CSF，取小鼠肾脏，提取组织RNA，逆转录成DNA后通过RT-PCR检测小鼠体内肾脏组织中EPO的mRNA水平。
　　7.给予小鼠皮下注射促红细胞生成素EPO，取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+各细胞群体所占比例。
　　8.给予小鼠体内注射EPO，取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏中Ter119+ Thiazole orange+(网织红细胞)，Ter119+Thiazole orange++（原红细胞和幼红细胞）群体所占比例。
　　9.给予小鼠体内注射G-CSF的同时，给予小鼠尾静脉输红细胞，采用FITC RatAnti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞所占比例。采用Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏细胞，观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。
　　10.给予小鼠体内注射G-CSF的同时，给予小鼠注射EPO抗体，封闭小鼠体内EPO，后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/Thiazole orange双染流式检测小鼠脾脏细胞，观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。
　　11.给予小鼠体内注射G-CSF的同时，给予小鼠喂服腺嘌呤，破坏小鼠双肾，阻断EPO分泌，后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/Thiazole orange双染流式检测小鼠脾脏细胞，观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。
　　12.给予小鼠体内注射G-CSF，后对实验组小鼠实施双侧肾脏切除手术，阻断EPO来源。2天后，处死小鼠，采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE RatAnti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏细胞，观察成熟红细胞，网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。
　　13.给予小鼠体内注射G-CSF，分别给药1天、2天，取小鼠肾脏，提蛋白，采用免疫印迹法检测在受G-CSF刺激后小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α、HIF-2α的表达情况。
　　结果:
　　1.在给予小鼠体内注射G-CSF后，小鼠股骨变白，骨髓细胞数减少，细胞中Ter119+CD71+细胞比例下降。相对应小鼠脾脏变大，颜色加深，细胞数增多，细胞中Ter119+CD71+细胞比例上升。
　　2.在给予小鼠体内注射G-CSF后，噻唑橙染色结果得出小鼠脾脏细胞Ter119+Thiazole orange+，Ter119+ Thiazole orange++群体均有显著上升，而小鼠骨髓细胞中Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+ Thiazole orange++细胞均明显减少。
　　3.细胞涂片结果显示:注射了G-CSF小鼠的骨髓细胞中红细胞数减少，粒细胞数增多。注射了G-CSF小鼠的外周血细胞涂片结果显示:外周血中粒细胞总数增多。
　　4.原代培养CFU-E结果显示，皮下注射G-CSF后小鼠脾脏细胞中CFU-E明显增多。
　　5.ELISA测定小鼠血清中EPO结果显示，给予小鼠G-CSF刺激以后，小鼠血清中EPO水平明显上升。
　　6.RT-PCR结果显示，在给与小鼠G-CSF刺激后，小鼠肾脏中EPO的mRNA水平显著上升。
　　7.检测受G-CSF刺激的小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α与HIF-2α表达水平。Western blot结果显示，给与小鼠G-CSF刺激后，小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α与HIF-2α表达水平上升。
　　8.给予小鼠外源性EPO刺激后，小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞比例上升。APC Rat Anti-Mouse Ter119和噻唑橙染色结果显示脾脏细胞中Ter119+Thiazole orange+（网织红细胞），Ter119+ Thiazole orange++（原红细胞和幼红细胞）群体均有显著上升。
　　9.在使用G-CSF刺激小鼠后，给小鼠尾静脉输入红细胞，流式检测脾脏细胞，发现相比G-CSF给药组，G-CSF给药同时输红细胞组Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+ Thiazole orange++细胞比例降低至正常对照组小鼠水平。
　　10.在小鼠受到G-CSF刺激的情况下，给小鼠注射一定量的EPO抗体封闭小鼠体内EPO的功能，流式检测脾脏细胞，发现Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++细胞比例恢复至正常对照组小鼠水平。
　　11.在小鼠受到G-CSF刺激的情况下，同时给予小鼠喂服腺嘌呤，小鼠脾脏细胞数恢复正常，流式细胞仪检测其脾脏细胞，发现Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++细胞比例恢复至正常对照组水平。如果同时再给脾脏恢复正常的小鼠外源EPO刺激，脾脏再度增大，细胞数增多，Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+Thiazole orange++细胞比例再次上升。
　　12.给小鼠G-CSF刺激一段时间后，切除小鼠双侧肾脏，两天后取脾脏，发现鼠脾脏明显缩小，流式检测其脾脏细胞，发现Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，ter119+ Thiazole orange++细胞比例相比G-CSF给药组亦明显降低。而后再给脾脏恢复正常的小鼠外源EPO刺激，脾脏再度增大，Ter119+CD71+细胞比例，Ter119+ Thiazole orange+，Ter119+ Thiazoleorange++细胞比例再次上升。
　　结论:
　　粒细胞集落刺激因子(G-CSF)抑制小鼠骨髓红细胞生成，造成机体缺氧，促进肾脏缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α表达，进而促进肾脏间质细胞分泌促红细胞生成素(EPO)，然后刺激小鼠脾脏红细胞生成。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对小鼠骨髓和脾红细胞生成的影响

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第二部分 G-CSF促进肾分泌促红细胞生成素(EPO)

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第三部分 破坏肾功能可抑制G-CSF诱导的脾红细胞生成

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．小结

结论

参考文献

致谢

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