E3连接酶TRIM26通过泛素化降解核内的IRF3负向调控IFN-β的产生和抗病毒免疫反应

摘要

目的:
　　TRIM26作为TRIM家族中重要的一员，之前在天然免疫中的研究是非常少的，鉴于TRIM家族的相似结构特点，考虑TRIM26作为一种E3连接酶是否会在天然免疫应答中起到泛素化修饰的作用，是否参与到TLR，RLR，NLR以及DNA信号通路介导的Ⅰ型干扰素的产生之中，并对机体的抗病毒免疫起到调控作用，同时验证TRIM26作用的靶分子以及是通过何种形式的泛素化形式起到相应的作用。
　　方法:
　　1.病毒感染对TRIM26的调控
　　1.1 病毒感染对TRIM26表达的影响
　　取小鼠的各种组织，利用Western Blotting方法，检测小鼠各组织中的TRIM26蛋白的表达。用LPS和poly(I∶C)刺激，以及SeV感染小鼠腹腔原代巨噬细胞，利用Western Blotting方法检测TRIM26在各种刺激以及感染情况下的表达变化。
　　1.2 TRIM26在细胞内的定位
　　构建带GFP荧光标签的TRIM26过表达载体，转染到HEK293细胞，利用免疫荧光技术观察TRIM26在细胞内的定位，同时，用LPS刺激或是SeV感染之后，免疫荧光检测一下TRIM26定位的变化。
　　2.TRIM26负向调控IFN-β的产生和抗病毒免疫
　　2.1 TRIM26过表达对IFN-β产生的影响
　　在RAW264.7细胞系中，转染TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体，培养过夜，之后用LPS和poly(I∶C)刺激转染过的RAW264.7细胞系，报告基因检测IFN-β活性水平。同样方法，利用报告基因方法在稳定表达TLR3,TLR4受体的HEK293细胞中检测TRIM26对IFN-β报告基因的活性水平。
　　2.2 TRIM26干扰之后对IFN-β产生的影响
　　取小鼠的腹腔原代巨噬细胞，利用转染小干扰RNA的方法，将TRIM26相应的干扰RNA转染进巨噬细胞，用LPS和poly(I∶C)刺激，以及SeV感染，ISD转染相应的时间，ELISA方法检测IFN-β的产生变化。
　　2.3 TRIM26的抗病毒影响
　　将TRIM26过表达载体转染Hela细胞，然后用VSV进行感染，RT-PCR检测IFN-β的产生变化以及VSV的mRNA水平的变化。将TRIM26过表达载体或是相应的小干扰RNA转染Hela细胞系，24小时后用VSV感染Hela细胞8小时，收集细胞上清，利用病毒空斑试验检测病毒的数量。
　　3.TRIM26靶分子的寻找
　　3.1 TRIM26对IRF3报告基因的影响
　　将TRIM26过表达载体转染稳定表达TLR3,TLR4的HEK293细胞之中，以及转染Hela细胞之中，然后用相应的配体进行刺激，分别用LPS和poly(I∶C)刺激TLR4,TLR3细胞系，以及SeV感染，ISD转染Hela细胞，利用报告基因方法检测TRIM26对IRF3报告基因的活性水平的影响。
　　3.2 TRIM26对接头分子的影响
　　在HEK293细胞中，转染TRIM26过表达载体以及相应的接头分子:TRIF,MAVS，STING+cGAS和TBK1,提取细胞蛋白，用Western Blotting方法检测TRIM26对IRF3磷酸化的影响。同样，转染TRIM26小干扰后，再用LPS刺激以及SeV感染之后，Western Blotting方法检测TRIM26干扰之后对IRF3磷酸化的影响。为了进一步确定TRIM26的靶分子，在HEK293细胞中，转染TRIM26过表达载体以及IRF3报告基因载体，报告基因方法检测TRIM26对各个接头分子TRIF, RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1和IRF3引起的IRF3报告基因活性的影响，进一步明确TRIM26作用的靶分子。
　　结果：
　　1.病毒感染对TRIM26的调控
　　1.1 病毒感染诱导TRIM26的表达
　　取小鼠各组织，利用Western Blotting方法，检测小鼠各组织中的TRIM26蛋白的表达，检测发现在小鼠的肺脏，胸腺，肝脏，脾脏，小肠以及脑组织之中，TRIM26都有大量的表达，但是在心脏和肾脏之中表达较少。用LPS和poly(I∶C)刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞时，在4小时开始，TRIM26表达开始出现增加，12到16小时时表达达到高峰，在SeV感染小鼠腹腔原代巨噬细胞时，利用WesternBlotting方法检测发现TRIM26的表达变化与LPS和poly(I∶C)刺激时相似。这说明TRIM26有可能参加到病毒感染引起的信号转导之中。
　　1.2 病毒感染引起TRIM26的入核
　　为了明确TRIM26在细胞内的定位，我们构建带GFP荧光标签的TRIM26过表达载体，转染到HEK293细胞，利用免疫荧光技术观察TRIM26在细胞内的定位，发现TRIM26在没有刺激的情况下是定位在细胞质中的。在细胞受到SeV, VSV感染8小时时，免疫荧光检测发现TRIM26出现明显的入核现象，同时，用LPS刺激稳定表达TLR4的HEK293细胞时，免疫荧光检测同样发现TRIM26出现明显的核定位现象。综上诉述情况说明TRIM26在病毒感染时会出现明显的细胞核定位现象。
　　2.TRIM26负向调控IFN-β的产生和抗病毒免疫
　　2.1 TRIM26抑制病毒感染引起的IFN-β的产生
　　为了验证TRIM26在抗病毒免疫反应中的作用，我们用报告基因的方法检测TRIM26对众多的PRRs引起的下游的IFN-β表达的影响。在RAW264.7细胞系中，转染TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体，培养过夜，之后用LPS和poly(I∶C)刺激转染过的RAW264.7细胞系，报告基因检测发现转染了TRIM26过表达载体的RAW264.7细胞系的IFN-β报告基因活性明显变弱。同样方法，利用报告基因方法在稳定表达TLR3,TLR4受体的HEK293细胞中检测TRIM26对IFN-β报告基因的活性水平也是出现了明显的下降。接下来，我们在HEK293以及Hela细胞中，共转染了TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体，转染过夜之后，用SeV感染以及poly(I∶C)转染进行刺激，转染ISD以及poly(dA∶dT)之后，报告基因检测发现TRIM26能明显下调各种刺激引起的IFN-β的报告基因活性。
　　2.2 TRIM26干扰之后对IFN-β产生的影响
　　为了更加直接的研究TRIM26对于IFN-β产生的影响，我们设计了TRIM26的小干扰RNA进行下面的实验。取小鼠的腹腔原代巨噬细胞，利用转染小干扰RNA的方法，将TRIM26相应的干扰RNA转染进巨噬细胞，转染36-48小时之后，用LPS和poly(I∶C)刺激，以及SeV感染，ISD转染分别6小时和12小时，ELISA方法检测发现TRIM26被干扰掉之后，IFN-β的产生出现明显的升高。这些结果说明TRIM26对病原微生物尤其是病毒感染之后引起的IFN-β的产生具有抑制作用。
　　2.3 TRIM26的抗病毒影响
　　为了更加直接的研究TRIM26对于机体抗病毒的影响，将TRIM26过表达载体转染Hela细胞，然后用VSV进行感染，RT-PCR检测IFN-β的产生变化以及VSV的mRNA水平的变化。我们发现转染了TRIM26过表达载体的Hela细胞系，产生的IFN-β，相对比于转染了空载体的Hela细胞系来说，IFN-β的表达明显下降，同时VSV mRNA水平在转染了TRIM26过表达载体的细胞系中，出现明显的升高，说明了TRIM26对抗病毒作用具有负向调控作用。接下来，将TRIM26过表达载体或是相应的小干扰RNA转染Hela细胞系，24小时后用VSV感染Hela细胞8小时，收集细胞上清，病毒空斑试验检测发现TRIM26过表达之后，VSV病毒空斑数量明显增多，相似的情况，当用TRIM26小干扰RNA之后，VSV病毒空斑数量出现相应的较少，病毒空斑实验说明了TRIM26对机体的抗病毒反应的负向调控作用。
　　结论：
　　1.首次揭示了TRIM26作为E3连接酶在天然免疫中的作用
　　TRIM26作为TRIM家族中的一员，其E3连接酶功能相对于其他家族成员来说，研究的不是很多，尤其是TRIM26在天然免疫中的作用，更是知之甚少，在这里，我们首先研究了TRIM26在抗病毒天然免疫中的作用，无论是在TLR，RLR还是DNA信号通路中，我们都做了详细的验证与说明。我们的研究证实了TRIM26作为一种E3连接酶可以在天然免疫中发挥重要的调控作用。
　　2.首次证实了TRIM26特异性的靶向作用于核内的IRF3
　　IRF3作为机体重要的转录因子，在调控机体的免疫反应中发挥着重要的作用，IRF3的活化需要磷酸化，二聚化以及核转位，之前虽有文章报道过IRF3可以被泛素化降解，但是到目前来说，没有一个明确的研究证实在核内降解活化形式的IRF3,我们的研究证实了TRIM26可以作为E3连接酶，入核之后，在细胞核之中与IRF3相互结合并且可以通过K48位泛素化降解核内活化的IRF3,这在以前是没有被发现过的，我们的研究进一步完善了抗病毒天然免疫的调控机制。

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摘要

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前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

E3连接酶TRIM家族在抗病毒天然免疫中的作用

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