高粱SbbHLH1互作蛋白、DNA结合序列的识别及毛白杨转基因的初步研究

摘要

高粱是重要的能源作物之一，其bmr突变体表现出低木质素含量。闫丽(2011)等利用以高粱野生型BTx623作为tester、以13种不同的bmr突变体作为driver构建的抑制差减杂交(SSH)文库，通过芯片杂交识别出大量转录差异的基因。SbbHLH1和SbLIM1是其中两个差异较明显的转录因子基因。前期的研究发现，SbbHLH1和SbLIM1影响拟南芥的木质素生物合成。本文对SbbHLH1调控木质素合成代谢机制及毛白杨的遗传转化进行初步的研究，探讨这两个转录因子对其木质素合成的影响。
　　采用酵母双杂技术可以研究与SbbHLH1转录因子的互作蛋白，结果发现SbbHLH1转录因子可以与高粱中的SB02G040140蛋白（也是一个bHLH类的蛋白）互作。表明了SbbHLH1转录因子会与其他的bHLH结构域蛋白结合，再参与到木质素的转录调控网络。采用SELEX技术分离得到了与SbbHLH1转录因子结合的DNA基序E-box（CANNTG），为了验证SbbHLH1转录因子能够结合拟南芥木质素生物合成途径相关基因启动子序列中的E-box基序，克隆这些序列，通过DNA和蛋白的结合实验发现SbbHLH1转录因子可以与AtPAL基因的启动子结合，这就进一步证明了SbbHLH1转录因子在拟南芥中可以通过结合PAL基因调控木质素的生物合成。
　　用携带载体pSTART-SbLIM1的农杆菌侵染毛白杨芽尖的外植体，通过组织培养、卡那霉素筛选、PCR鉴定获得12株阳性植株。同时对三年生SbbHLH1转基因毛白杨及SbLIM1转基因毛白杨的木质素含量进行测定，结果发现转基因毛白杨的部分个体及枝条木质素含量均有所下降，RT-PCR及Real-TimePCR结果也表明，SbLIM1和SbbHLH1转基因毛白杨中木质素生物合成途径相关基因的表达下降的种类和数量不尽相同。说明这两个高粱的转录因子以不同的方式调控毛白杨木质素的合成，该结果也表明利用SbLIM1和SbbHLH1转基因杨树，可以获得低木质素的生物纤维材料，有望成为新的高效生物质能源。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．可再生能源概述及生物质能源在可再生能源中的地位

1．1 可持续发展与可再生能源

1．2 生物质能源在可再生能源中的地位

2．生物质燃料——燃料乙醇的生产

2．1 生产乙醇燃料的生物质来源

2．2 生产乙醇燃料的木质纤维素的来源

2．3 木质纤维素乙醇生产存在技术瓶颈

2．4 降低去木质化技术的成本的方法

3．bHLH类转录因子简介

3．1 bHLH类转录因子结构和分类

3．2 植物中和动物中的bHLH蛋白结合元件的比较

4．植物中LIM转录因子简介

5．立题依据和研究内容

第二章 SbbHLH1转录因子调控网络的研究

1．引言

2．实验材料及试剂

2．1 植物材料

2．2 菌株与载体

2．3 主要试剂和试剂盒

2．4 主要培养基

2．5 主要缓冲液

3．实验方法

3．1 酵母双杂

3．2 SbbHLH1融合蛋白的诱导和纯化

3．3 SELEX技术

3．4 SbbHLH1转录因子与DNA的结合试验

4．结果与分析

4．1 酵母双杂试验结果

4．2 SELEX试验结果

4．3 SbbHLH1转录因子与启动子结合的电泳分析

5．讨论

第三章 SbLIM1对杨树的转化及相关数据的测定

1．引言

2．试验材料及试剂

2．1 植物材料和菌株

2．2 培养基和溶液

3．试验方法

3．1 杨树外植体的快繁

3．2 用携带载体SbLIM1-pSTART的农杆菌侵染杨树的外植体

3．3 转基因株系木质素含量的测定

3．4 杨树切片的Wiesner染色

4．结果与分析

4．1 SbLIM1转化毛白杨与阳性植株的筛选

4．2 SbLIM1转基因毛白杨的鉴定

4．3 对SbbHLH1转基因阳性植株枝条的检测

4．4 SbLIM1和SbbHLH1转基因毛白杨木质素的测定

4．5 SbLIM1和SbbHLH1转基因毛白杨中相关Marker基因的表达模式分析

5．讨论

总结

附录

参考文献

致谢