碳原子数目及官能团对有机氟化合物与DNA毒性作用影响的研究

摘要

近年来，环境污染问题逐渐成为困扰世界各国发展的瓶颈，因此，环境污染与健康的关系越来越受到人们的关注。持久性有机污染物(POPs)主要来源于人类生产和生活活动，持久性有机污染物会通过直接或间接的方式干扰生物体的内分泌以及生殖、免疫、神经系统等，造成严重后果。全氟有机化合物中的PFOS就是一类常见的POPs。DNA是生物体遗传信息“谱图”，与蛋白质的合成和遗传信息的表达有关，在生物的生命活动中作用显著。经研究报道，持久性有机污染物能够造成DNA损伤，引发基因突变、染色体畸变等严重问题，甚至导致恶性肿瘤。研究不同碳原子数目和官能团有机氟化合物对DNA的毒性作用具有非常重要的意义。
　　有机氟化合物，是指分子中全部或部分C-H键转化为C-F键的有机化合物。目前，最常见的有机氟化合物主要是全氟化合物（PFAAs）及氟喹诺酮类药物(FQs)两大类。我们选取全氟戊酸(PFPA)、全氟辛酸(PFOA)和全氟癸酸(PFDA)这三种碳原子数目不同的PFAAs为研究对象，以小鼠原代肝细胞和小牛胸腺DNA(ctDNA)为靶物质，通过体外模拟生理条件，分别从细胞水平和分子水平两个层面研究PFAAs引发DNA损伤的机理，并探究碳原子数目对PFAAs毒性作用的影响。同时，我们选取恩诺沙星(ENFX)为FQs代表化合物，以小牛胸腺DNA(ctDNA)为靶分子，结合PFAAs分子毒性机理，探究官能团对有机氟化合物毒性机理的影响。论文由以下三部分组成:
　　第一部分:通过细胞count&viability实验、彗星实验、8-OHdG含量测定及细胞ROS水平测定等较系统的研究结果证实，就任何一种PFAAs而言，PFAAs暴露剂量越大，造成的小鼠肝细胞DNA损伤越严重，PFAAs对小鼠肝细胞的毒性存在剂量-效应关系。而在相同染毒浓度下，经过三种碳原子数不同的PFAAs暴露的研究发现，随着PFAAs中碳原子数目的增加，各项彗星指标值显著增加，DNA损伤标记物8-OhdG含量测定的结果与彗星实验一致。证实了PFAAs的碳原子数目与PFAAs的毒性作用存在正相关关系，即碳链越长的PFAAs毒性效应越明显。另外，结合研究结果推断小鼠肝细胞内的DNA损伤可能是由于PFAAs引起小鼠体内氧化应激，导致活性氧物质增加，破坏细胞内氧化还原平衡，最终诱发了DNA的损伤。
　　第二部分:将DNA分子直接暴露于PFAAs下，通过紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱、圆二色谱、ITC、分子模拟等实验方法和手段，在分子水平上探究PFAAs与DNA直接作用机理，建立其作用模型研究发现，PFAAs会导致DNA发生荧光猝灭，随着浓度的增多、碳原子数目的增加，猝灭作用越强烈。通过各种光谱学及热力学手段，我们发现PFAAs与DNA倾向于以沟槽作用相结合，并可以通过氢键和范德华力的方式加强两者的沟槽结合。同时随着碳链长度的增长，结合作用越强。
　　第三部分:选取与上述PFAAs具有不同官能团的FQs代表化合物ENFX，利用紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱、磷酸盐效应和盐效应、ITC、荧光寿命、分子模拟等研究技术和手段，在分子水平上探究ENFX与DNA作用的模式，研究发现，DNA使具有内源荧光的ENFX发生荧光猝灭，随着DNA浓度的增加，猝灭作用越强烈，以静态猝灭模式发生猝灭。就结合模式而言，ENFX与DNA倾向于以嵌插作用相结合，通过氢键和范德华力加强相互作用，这主要与ENFX中含有平面共轭芳香环有关。
　　本论文的研究结果表明，有机氟化合物具有明显的基因毒性，能够影响DNA结构和功能，毒性存在剂量-效应关系。除此之外，经对比研究发现，结构相似、属于同系物的有机氟化合物的毒性主要取决于其碳原子数目，即碳原子数目越多，毒性作用越强。而结构不同的有机氟化合物，其毒性与官能团有关，官能团不同会导致有机氟化合物与DNA的作用模式不同。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 有机氟化合物的毒性研究进展

1．1．1 有机氟化合物的污染研究现状

1．1．2 有机氟化合物的一般毒性机理

1．1．3 有机氟化合物毒性评价中存在的问题

1．2 脱氧核糖核酸(DNA)概述

1．2．1 DNA的结构

1．2．2 DNA的物理化学性质

1．2．3 DNA与小分子的作用模式

1．3 研究方法与技术

1．3．1 细胞水平

1．3．2 分子水平

1．4 论文的研究目的、研究内容和研究意义

1．4．1 论文的研究目的

1．4．2 论文的研究内容

1．4．3 论文的研究意义

第二章 细胞水平上探究全氟化合物(PFPA，PFOA，PFDA)对DNA毒性作用的影响

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验动物

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 PFAAs对细胞活力影响的研究

2．3．2 单细胞凝胶电泳

2．3．3 PFAAs诱导细胞内8-OHdG含量变化的探究

2．3．4 PFAAs对细胞内ROS含量变化的探究

2．3 小结

第三章 分子水平上探究全氟化合物(PFPA，PFOA，PFDA)对DNA毒性作用的影响

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 紫外-可见吸收光谱

3．3．2 荧光猝灭光谱的探究

3．3．3 圆二色谱

3．3．4 ITC

3．3．5 分子对接

3．4 小结

第四章 分子水平上探究恩诺沙星(ENFX)对DNA毒性作用的影响

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 ENFX与DNA相互作用的紫外-可见吸收光谱

4．3．2 DNA对ENFX荧光光谱的探究

4．3．3 以中性红为探针，探究ENFX与DNA的结合方式

4．3．4 磷酸盐效应和盐效应

4．3．5 itc

4．3．6 时间-分辨荧光光谱

4．3．7 分子对接

4．4 小结

第五章 主要结论及研究展望

5．1 主要结论

5．1．1 细胞水平上探究PFAAs对DNA的毒性作用机理

5．1．2 分子水平上探究PFAAs对DNA结构和功能的影响

5．1．3 分子水平上探究ENFX对DNA结构和功能的影响

5．2 论文的创新点

5．3 论文不足及研究展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的科研情况