Tsi1-Tse1蛋白质复合物结构解析及过氧化氢与两种蛋白质的作用机制研究

摘要

作为生物体中的一种最重要的生物大分子，蛋白质的结构解析已经成为蛋白质组学的一个至关重要的研究课题。蛋白质的三维结构、运动及其相互作用共同决定了蛋白质、DNA等生物大分子的生物学功能。蛋白质的各级结构之间的关系，以及同种或者不同种蛋白质分子之间的相互作用的规律研究对于理解生命过程是极具价值的。蛋白质与各种生物大分子间的相互作用决定了生物体内诸多与个体发展以及细胞交流密切相关的生物过程，包括复制、转录、转译、转移、细胞凋亡和其他信号通路。
　　论文第一章详细介绍了蛋白质结构及其相互作用研究的现状和方法，在文献综述的基础上比较了各种研究方法的优缺点及适用对象，并阐述了借助蛋白质氧化标记进行蛋白质结构解析的基本原理。
　　论文第二章介绍了细菌Ⅵ型分泌系统的生物组成和功能，以及本论文的研究目标Tse1蛋白，Tsi1蛋白，Tsi1-Tse1复合物的结构和功能。采用·OH标记从铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统中提取的Tse1效应蛋白和与其对应的免疫蛋白Tsi1蛋白以及Tsi1-Tse1复合物，进而解析Tse1蛋白与Tsi1蛋白间的作用界面。具体的实验路线为:(1)将Tse1效应蛋白，Tsi1免疫蛋白和Tsi1-Tse1复合物溶液同时置于γ射线照射环境中，水分子分解生成·OH，借以标记三种蛋白质;(2)采用LC-MS分析技术定性、定量地检测氧化标记前后同一个多肽在Tse1蛋白，Tsi1蛋白以及Tsi1-Tse1复合物中的氧化标记程度。如果在照射后，某个肽段在复合物中的氧化标记程度小于其在单体中的氧化标记程度，则认为该肽段有可能位于Tsi1和Tse1的作用界面上。实验结果表明，多肽(49-68)DNCSGFVQSVAAELGVPMPR,(109-123) TYGHVAVVISGPLYR,(126-145)YPMCWCGSIAGAVGQSQGLK，(159-173) LNYYVYSLASCSLPR在复合物Tsi1-Tse1中的氧化程度明显低于其在Tse1蛋白中的氧化标记程度。因此，猜测Tse1中的这四个多肽可能位于Tsi1和Tse1的结合部位。多肽(63-71)IEDGGIWSR,(83-104) LMHEFSGSSAELVSYDSATCK和(116-120) WAVDK以及(144-153) SLAPFCQTAK在复合物Tsi1-Tse1中的氧化标记程度低于其在Tsi1中的氧化标记程度。因此，这四个多肽片段可能位于Tsi1和Tse1的结合部位。
　　论文第三章利用经典的光谱学方法（荧光光谱、同步荧光光谱、紫外可见光谱、圆二色谱等）以及分子模拟软件，从分子水平上研究了过氧化氢(H2O2)与胰蛋白酶的相互作用机制，并分析了H2O2对胰蛋白酶的结构和功能影响。结合常数和荧光寿命实验结果共同表明，H2O2使胰蛋白酶发生了静态猝灭。热力学参数焓变和熵变数值均小于零，说明氢键作用和范德华力是复合物生成过程中的主要作用力。紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱的结果共同表明，H2O2与胰蛋白酶的结合改变了胰蛋白酶的结构和色氨酸的微环境。因H2O2的加入，胰蛋白酶的α螺旋百分比从4.5％增加到5.7％，而β折叠含量从45.4％减少到42.8％。但是，H2O2与胰蛋白酶的作用位点离胰蛋白酶的活性中心较远，因此胰蛋白酶的活性未发生明显的改变。
　　论文第四章对比研究了H2O2与人血清白蛋白的作用机制。整体来说，H2O2与这两种不同类型的蛋白质的结合存在诸多相似之处，但又因胰蛋白酶和血清白蛋白的特殊性存在差异。实验结果表明，H2O2引起的HSA的荧光猝灭作用仍属于静态猝灭，二者之间的结合符合1∶1结合模式。热力学参数表明，氢键作用和范德华力是H2O2与HSA分子间的主要作用力。与胰蛋白酶不同的是，H2O2对HSA中的酪氨酸和色氨酸的影响基本一致。H2O2同样导致了HSA的骨架结构变得松散。而且，H2O2的存在使HSA和胰蛋白酶中的α螺旋含量升高，β折叠含量降低。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 蛋白质结构研究

1．1．1 蛋白质结构研究概况

1．1．2 蛋白质结构研究方法

1．2 蛋白质-蛋白质相互作用研究

1．2．1 蛋白质-蛋白质相互作用研究概况

1．2．2 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法

1．3 蛋白质结构及其相互作用研究的意义

1．4 蛋白质的氧化

1．4．1 肽键断裂

1．4．2 氨基酸残基的氧化

1．5 论文的研究内容和意义

1．5．1 研究内容

1．5．2 研究意义

第二章 Tsi1-Tse1蛋白质复合物结构解析

2．1 引言

2．1．1 细菌Ⅵ型分泌系统简介

2．1．2 Tse1蛋白，Tsi1蛋白和Tsi1-Tse1复合物的结构

2．1．3 Tsi1-Tse1复合物的功能

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 Tse1蛋白和Tsi1-Tse1复合物酶解产物的定性分析

2．3．2 Tse1蛋白和Tsi1-Tse1复合物的氧化程度分析

2．3．3 Tsi1蛋白和Tsi1-Tse1复合物酶解产物的定性分析

2．3．4 Tsi1蛋白和Tsi1-Tse1复合物的氧化程度分析

2．4 小结

第三章 过氧化氢对胰蛋白酶的作用机制研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 胰蛋白酶的猝灭机制分析

3．3．2 结合常数和热力学参数的计算

3．3．3 H2O2对胰蛋白酶的氨基酸微环境的影响

3．3．4 胰蛋白酶的三维荧光光谱

3．3．5 H2O2对胰蛋白酶的分子骨架结构影响

3．3．6 H2O2对胰蛋白酶的二级结构影响

3．3．7 H2O2对胰蛋白酶的活性影响

3．3．8 Trypsin-H2O2复合物的分子模拟

3．4 小结

第四章 过氧化氢对人血清白蛋白的作用机制研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 HSA的荧光猝灭机制分析

4．3．2 结合常数和热力学参数的计算

4．3．3 H2O2对HSA的氨基酸微环境的影响

4．3．4 H2O2对HSA的骨架结构影响

4．3．5 H2O2对HSA的二级结构影响

4．3．6 HSA-H2O2复合物的分子模拟

4．4 小结

第五章 结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的科研情况及获得的荣誉