鼠衣原体肺部二次感染中NK细胞对免疫应答的调节作用

摘要

衣原体（Chlamydia）是一种严格胞内寄生的原核细胞型微生物，其中沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）感染可引起机体多种感染性疾病，如:生殖道感染引起的输卵管炎、不育症，呼吸道感染引起的肺炎、支气管炎，以及眼部粘膜感染引起的沙眼。沙眼农原体感染是一个长期慢性的过程，机体产生的细胞免疫反应强度如果不足以彻底清除细胞内寄生的衣原体，易形成持续性感染与组织病理损伤。在机体应对沙眼衣原体感染时，CD4+T细胞起主导性保护作用，产生的多种Th1类细胞因子，如:IFN-γ、IL-2、TNF-α，在沙眼衣原体生殖道和肺部感染中均发挥重要的抗感染作用。其中IFN-γ除可直接抑制衣原体复制外，还对适应性免疫细胞起重要调节作用。B细胞以及衣原体特异性抗体也具有一定的保护性作用，并与CD4+T细胞有协同作用，而CD8+T细胞在抗沙眼衣原体感染中的作用比较微弱。
　　自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体固有免疫系统的重要成员，在抵抗病原体感染中发挥重要作用。NK细胞的活化是其表面的活化和抑制性受体相互作用，共同介导完成的。NK细胞抗感染免疫功能的发挥主要依靠两条途径实现:1.通过识别被感染细胞，直接杀伤靶细胞;2.通过IFN-γ、IL-2等细胞因子的分泌，以及与DC的相互作用，募集和调节适应性免疫细胞的应答，抑制病原体的扩增。NK细胞杀伤能力和细胞因子分泌能力的激活依赖于其所处的细胞因子微环境，以及与免疫系统其他细胞的相互作用。传统意义上，NK细胞主要在初次感染的早期应答中发挥作用。最近有报道证实，NK细胞在病原体二次感染（如:结核杆菌、呼吸道合胞病毒）引起的机体免疫应答中也发挥重要作用。
　　我们前期工作发现，衣原体感染可以激活NK细胞;在小鼠衣原体肺部初次感染中，NK细胞可通过调节CD4+T细胞亚群的分化，进而发挥抗感染的免疫保护作用。小鼠体内NK细胞清除后，衣原体肺部感染加重，免疫保护性的Th1和Th17类细胞数量减少，免疫抑制性的Treg细胞数量增多。
　　本文在以上工作基础上，进一步探讨了NK细胞在衣原体肺部二次感染中发挥的作用及其免疫机制。
　　一、小鼠肺部衣原体二次感染模型建立和二次感染小鼠体内T细胞应答特点
　　目的:探讨与一次感染相比，衣原体肺部二次感染后，主要CD4+T细胞亚群的应答特点。方法:C57BL/6小鼠滴鼻吸入含鼠肺炎衣原体（Chlamydiamuridarum）的感染液，建立小鼠肺部一次感染;一次感染后6-8周（感染已完全恢复），小鼠再次滴鼻感染建立小鼠肺部二次感染模型。采用同龄小鼠初次滴鼻感染，作为一次感染组。记录体重绘制体重变化曲线;间接计数法检测小鼠肺部包涵体形成单位(IFUs)数量;流式细胞术检测两组小鼠体内主要CD4+T细胞亚群Th1、Treg细胞数量。结果:与一次感染组相比，二次感染组小鼠的体重降低趋势明显减轻，肺部IFUs明显降低，疾病恢复进程加快;细胞内细胞因子染色结果显示，感染后6天，二次感染组小鼠的脾、纵膈淋巴结和肺组织中IFN-γ+CD4+T细胞（即Th1细胞）均显著增多。Foxp3+CD25+CD4+T细胞（即Treg细胞）在一次感染和二次感染后均有扩增，但两组间没有明显数量差异。结论:成功建立小鼠二次肺部感染模型;在衣原体二次感染中，Th1细胞迅速激活并扩增，是疾病迅速恢复的主要免疫机制。
　　二、NK细胞在小鼠肺部衣原体二次感染中的作用及机制
　　目的:探讨NK细胞在衣原体肺部二次感染中的作用及机制。方法:采用小鼠肺部衣原体二次感染模型，实验组小鼠在二次感染的-2、-1、1、3、5天分别尾静脉注射anti-asialo GM1 NK细胞中和抗体以清除体内NK细胞，二次感染对照组小鼠在同时间点注射同型抗体。体重记录绘制体重变化曲线;间接计数法检测小鼠肺部IFUs; ELISA技术检测脾、纵膈淋巴结、肺中单个核细胞培养上清中IFN-γ分泌量;流式细胞术检测两组小鼠体内（脾、纵膈淋巴结、肺）Th1、Treg细胞数量。结果:注射anti-asialoGM1抗体使小鼠体内NK细胞得到有效清除，二次感染后4天肺中NK细胞封闭效果可达到90.5％。二次感染后，与同型对照组相比，NK细胞清除组小鼠肺部IFUs数量均增多，且感染后3天差异更加显著。二次感染后NK细胞清除并没有对小鼠体重下降造成明显影响。感染后6天，与对照组相比，NK细胞清除组小鼠脾、纵膈淋巴结及肺中单个核细胞培养上清中IFN-γ分泌量均显著减少;NK细胞清除组小鼠的脾、淋巴结及肺中Th1细胞亚群在CD4+T细胞中所占比例均有所减少，但Treg细胞亚群比例有所增高。在衣原体二次感染中，NK细胞的清除对体内衣原体特异性IgG、IgG2a、IgG1的产生无明显影响。说明NK细胞清除使二次感染小鼠肺部的衣原体载菌量增加，并在一定程度上削弱了机体Th1细胞应答，增强了Treg细胞应答。结论:在衣原体肺部二次感染中，NK细胞仍发挥一定的免疫保护作用，其机制可能与其通过免疫调节作用促进Th1细胞增殖，抑制Treg细胞应答有关。
　　综上所述，本研究发现:1）衣原体肺部二次感染后，小鼠体内Th1细胞亚群显著扩增，但Treg细胞亚群没有明显变化。提示Th1细胞免疫应答的增强是二次感染疾病恢复进程加快的主要原因。2）二次感染后NK细胞清除组小鼠肺部衣原体载菌量增多，但小鼠体重变化差异不具有统计学意义。3）二次感染后NK细胞清除组小鼠体内（脾、淋巴结、肺）分泌IFN-γ水平下降、Th1细胞的比例减少、Treg细胞的比例增高。证明在衣原体肺部二次感染中，NK细胞发挥一定的抗感染保护作用，其可通过促进Th1细胞增殖、抑制Treg细胞应答，加强机体对衣原体的清除。该研究加深了对衣原体感染免疫机制的认识，为衣原体相关疾病的防治提供了新思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 衣原体一次感染的特点

2 衣原体二次感染的特点

3 NK细胞在病原体一次感染和二次感染中的作用

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

第一部分：小鼠肺部衣原体二次感染模型建立和二次感染小鼠T细胞应答特点

第二部分：NK细胞在小鼠肺部衣原体二次感染中的作用及机制

讨论

创新点

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文目录