Caveolin-1/NF-κB/HMGB1通路在内皮损伤中的作用和高脂血症中普罗布考保护EPC的机制

摘要

本研究分为以下两个部分:
　　第一部分 Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路在ox-LDL诱导内皮细胞损伤及巨噬细胞迁移中的作用
　　目的:
　　观察Caveolin-1、NF-κB和HMGB1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用而进一步明确ox-LDL损伤内皮的机制，并探讨该通路尤其是HMGB1在损伤内皮细胞诱导巨噬细胞迁移中的作用
　　方法:
　　1.在ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的实验中，将人脐静脉内皮细胞株CRL-1730细胞接种到细胞培养瓶中，在细胞生长至80％单层细胞融合时，对细胞进行分组并以不同浓度的ox-LDL处理内皮细胞来构建内皮细胞损伤模型。实验组的ox-LDL浓度梯度分别为10、20、40μg/ml，而以同等体积的PBS处理内皮细胞作为对照组。加入ox-LDL或者PBS后的内皮细胞孵育24h后，按照相应的要求分别提取细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞核蛋白和细胞总蛋白，并通过Western Blot检测蛋白提取物中caveolin-1和NF-κB p65的表达和磷酸化水平与细胞色素C(cytochrome C，CytC)C和HMGB1在细胞内的分布。
　　2.在siRNAs转染实验中，将HUVECs接种于6孔板内（2×105个/孔），每孔中加入2ml含10％胎牛血清、不含双抗的培养基，培养至约50％单层细胞融合时洗涤细胞，然后分别加入按照要求配制好的si-Cav1、si-p65或si-HMGB1，孵育12h后向各试验组中加入ox-LDL（终浓度为40μg/ml）处理内皮细胞。再孵育24h后，离心后收集细胞，按照相应的要求提取细胞总蛋白和细胞浆蛋白，并通过Western Blot检测细胞总蛋白中caveolin-1和NF-κB p65的表达和磷酸化水平、细胞浆蛋白中CytC的表达水平、细胞总蛋白中Pro-caspase-3和剪切活化后的caspase-3的表达水平与细胞总蛋白和胞浆蛋白中HMGB1的表达水平。我们还收集了各组细胞的培养基，经离心后获得细胞培养基上清液，并以Western Blot检测了由内皮细胞释放到胞外的HMGB1的相对水平。
　　3.在细胞凋亡实验中，用si-Cav1、si-p65和si-HMGB1以上面介绍过的步骤分别转染HUVECs沉默相应蛋白后再以ox-LDL（终浓度为40μg/ml）处理转染后的各组HUVECs24h。向另一组HUVECs加入同等体积的PBS作为对照组。以Annexin V和PI双标染色，通过流式细胞术检测各组内皮细胞的凋亡水平。
　　4.在细胞免疫荧光实验中，我们将dil标记的ox-LDL以40μg/ml终浓度加入分别转染si-Cavl、si-p65或si-HMGB1后的各组HUVECs培养基中，避光孵育6h后吸去培养基，PBS漂洗，以4％多聚甲醛室温下固定细胞，用3％的Triton-X100室温下破膜。以羊血清室温下封闭后，加入1∶500兔抗人HMGB1单抗在4℃下孵育过夜，然后加入1∶20的FITC标记的羊抗兔的荧光二抗在37℃下孵育45min，以PBS漂洗后应用抗荧光淬灭封片液封片，在暗室中分别以490/525nm、550nm/565nm为激发光/滤光频率在荧光显微镜下观察。每张玻片同取200倍数放大，取5个不同视野，观察HUVECs内ox-LDL的含量和HMGB1的表达。
　　结果:
　　1.Ox-LDL以浓度依赖的方式上调caveolin-1的表达和磷酸化水平，促进NF-κBp65的磷酸化和CytC由线粒体向细胞浆的释放，并上调HMGB1在细胞浆内表达水平而下调HMGB1的胞核内表达水平。
　　2.Ox-LDL引起HUVECs内caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路的显著激活:ox-LDL诱导caveolin-1的表达及磷酸化水平上调，然后磷酸化激活NF-κB，继而上调HMGB1的表达及其由胞核向胞浆内的迁移;caveolin-1表达和磷酸化的上调激活的NF-κB反过来进一步上调caveolin-1的表达和磷酸化。
　　3.Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路在ox-LDL诱导的HUVECs损伤和凋亡中发挥着重要作用:敲除caveolin-1可以显著抑制ox-LDL诱导的HUVECs内的线粒体损伤和HUVECs的凋亡;敲除NF-κB p65可以显著阻断ox-LDL诱导的线粒体损伤、caspase-3的活化和HUVECs的凋亡;在ox-LDL处理之前，抑制HMGB1的表达显著引起HUVECs中线粒体的损伤;但是，在ox-LDL刺激后，敲除HMGB1显著上调ox-LDL诱导的HUVECs内的线粒体损伤、caspase-3剪切活化和HUVECs的凋亡。
　　4.Caveolin-1、NF-κB、HMGB1在内皮细胞摄取ox-LDL的过程中发挥着重要的调节作用:ox-LDL可以诱导HUVECs摄取ox-LDL和HUVECs内HMGB1的表达;caveolin-1和NF-κB p65的沉默可显著抑制HUVECs对ox-LDL的摄取和ox-LDL诱导的HMGB1在HUVECs内的表达;而沉默HMGB1显著促进了HUVECs对ox-LDL的摄取。
　　结论:
　　Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路在内皮细胞摄取ox-LDL及ox-LDL诱导HUVECs损伤过程中发挥着重要作用。Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信号通路参与了损伤内皮诱导巨噬细胞迁移的过程，但损伤内皮细胞释放的HMGB1并未直接在诱导巨噬细胞迁移中发挥主要作用。
　　第二部分 Ox-LDL损伤在体内皮祖细胞及普罗布考在高脂血症中保护内皮祖细胞的机制
　　目的:
　　探讨体内环境下ox-LDL损伤内皮祖细胞的机制及普罗布考在高脂血症中保护内皮祖细胞的可能机制。
　　方法:
　　1.动物研究部分
　　1.1 制备ox-LDL
　　抽取健康志愿者的10ml外周静脉血，置于肝素化的离心管中，以1500g离心20min收集血浆。以KBr将血浆密度调整至1.30g/ml，并铺设生理盐水层，以10℃、35000g离心60min，收集LDL。将LDL置于PBS中过夜透析。过滤后以Lowry法进行脂蛋白浓度定量后，以CuSO4氧化LDL-c，加入DETA溶液终止反应，即可获得ox-LDL溶液。
　　1.2 制备高脂血症模型
　　将24只4-6周大的野生型雄性C57BL/6小鼠随机分入三组:对照组、ox-LDL组和普罗布考组。Ox-LDL组和普罗布考组小鼠均每日接受一次尾静脉注射50μg ox-LDL，连续3日，而对照组小鼠相应地接受同等体积的PBS注射。普罗布考组小鼠在接受ox-LDL处理前一天开始接受500mg/kg/d普罗布考灌胃，连续3日。灌胃前，首先将普罗布考溶于99％的乙醇溶液中，并进而以PBS稀释。
　　1.3 检测细胞内和细胞外的ROS水平
　　小鼠经过尾静脉连续注射ox-LDL或者PBS3日后，取血和骨髓，并收集到肝素化的试管内。用红细胞裂解液裂解红细胞，分别以流式细胞术或电子顺磁共振法检测外周血细胞内ROS生成与骨髓细胞外ROS生成水平。
　　2.临床研究部分
　　签署知情同意书的10名合并高血脂的冠心病患者和5位年龄和性别匹配的健康志愿者纳入了研究。患者根据性别和年龄分层后随即分入普罗布考处理组和安慰剂组。
　　2.1 收集基线数据
　　基线时，受试者空腹12h后抽取外周静脉血，通过电化学发光法检测患者的血脂、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，以ELISA法检测患者血浆ox-LDL水平;在去除红细胞后以标志物组合CD34+/KDR+来标记人外周血中的EPC，经流式细胞术检测人外周血中EPC水平。
　　2.2 药物治疗
　　普罗布考组和安慰剂组分别接受普罗布考500mg或安慰剂每日两次口服治疗，连续7日。过程中，采用双盲的方式减少偏倚。
　　3.数据分析
　　数据以均值士标准差来表示，以非配对t检验来比较2组数据，以双变量方差分析来比较3组间是否存在显著性差异。以Shapiro-Wilk W-test来检验数据是否为正态分布，以F-检验来检验方差齐。如果数据为非正态分布或者方差不齐时使用非参数Mann-Whitney U-test来比较数据。以P＜0.05（双侧）为差异存在统计学意义。
　　结果:
　　1.普罗布考阻断ox-LDL诱导的骨髓单个核细胞的减少和外周血中的EPCs水平。
　　2.普罗布考削弱了ox-LDL诱导的细胞内外的ROS的生成。
　　3.普罗布考降低了高脂血症患者血清中的ox-LDL水平，而上调外周血中的EPCs水平。
　　4.普罗布考增加高脂血症患者外周血血浆中的SOD水平而降低CRP水平。
　　结论:
　　在体内，ox-LDL诱导的氧化应激参与了内皮祖细胞的损伤。通过抑制骨髓、外周血中细胞外ROS的生成和外周血中细胞内ROS的生成，普罗布考能够有效地阻断ox-LDL对外周血内皮祖细胞及骨髓单个核细胞损伤。临床试验中，普罗布考部分地逆转了高脂血症患者外周血中内皮祖细胞的减少。这种保护作用可能与普罗布考降低高脂血症患者体内ox-LDL和C反应蛋白的水平而增加SOD水平有关。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 Caveolin-1／NF／κB／HMGB1信号通路在ox-LDL诱导内皮细胞损伤及巨噬细胞迁移中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分 Ox-LDL在体内通过氧化应激损伤内皮祖细胞及普罗布考的保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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