p16蛋白对喉癌生长的抑制和对自然杀伤细胞抗肿瘤免疫的调控

摘要

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其主要的病理类型为鳞状细胞癌。
　　本课题将研究p16蛋白对人喉癌细胞系Hep-2生长的影响，并从细胞凋亡和细胞周期两个方面进行机制探讨。还将初步探讨Hep-2细胞的p16蛋白导入与机体NK细胞抗肿瘤作用之间的关系，为p16作为肿瘤治疗靶点的应用提供更为详实的理论依据。
　　目的:
　　1.扩增携带野生型p16基因的重组腺病毒载体，并导入人喉癌细胞Hep-2中，观察p16蛋白的表达情况。
　　2.观察表达野生型p16蛋白的人喉癌Hep-2细胞的增殖情况，并从细胞凋亡和细胞周期两方面探讨其作用机制。
　　3.初步探讨表达野生型p16的人喉癌Hep-2细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化，同时观察该细胞对NK细胞杀伤活性的调控作用。
　　方法:
　　第一部分 重组腺病毒载体的扩增及其感染喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达情况
　　利用人胚肾细胞系HEK-293扩增携带野生型p16基因的重组腺病毒载体;采用293细胞空斑试验测定重组腺病毒的滴度;重组腺病毒感染Hep-2细胞后，采用流式细胞术和Western blot法检测p16蛋白的表达情况。
　　第二部分 野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2体外生长和体内生长的影响
　　采用CCK8法检测p16蛋白对Hep-2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测p16蛋白对Hep-2细胞凋亡率和细胞周期的影响;采用电子显微镜观察细胞凋亡的形态;采用Q-PCR法检测相关细胞凋亡蛋白和细胞周期蛋白的基因表达情况;Hep-2细胞接种于裸鼠背部皮下，采用重组腺病毒瘤内注射的方式观察p16蛋白体内抑瘤作用;采用Tunnel法检测瘤体组织的细胞凋亡情况。
　　第三部分 野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2与NK细胞之间相互作用的影响
　　采用CCK8法检测p16导入后喉癌Hep-2细胞对NK细胞杀伤敏感性的情况;流式细胞术检测p16导入后Hep-2细胞表面NK活化受体配体的表达情况;qRT-PCR检测p16导入后Hep-2细胞IL-6、IFN-γ、IL-10和TGF-β的基因表达情况;ELISA检测p16导入后Hep-2培养上清中TGF-β的分泌情况;p16蛋白导入后Hep-2细胞培养上清孵育NKL细胞，CCK8法检测该NKL对Hep-2细胞的杀伤情况;采用添加或阻断的TGF-β方式，确认Hep-2细胞培养上清的TGF-β是否参与了对NK细胞杀伤功能的调节作用。
　　结果:
　　第一部分 重组腺病毒载体的扩增及其感染人喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达情况
　　1.利用HEK-293细胞扩增重组腺病毒载体后，采用293细胞空斑试验测定重组腺病毒的滴度，Ad-p16的滴度为6.5×1010，Ad-LacZ的滴度为4.8×1010。
　　2.流式细胞仪检测p16蛋白表达的结果显示，Ad-p16组Hep-2细胞感染重组腺病毒3h、6h、12h和24h时p16蛋白的表达率分别为29.5％、85.0％、92.7％和95.4％。未感染Ad-p16组的Hep-2细胞中无p16蛋白表达。
　　3.Western blot检测结果也显示Ad-p16感染的Hep-2有明显p16蛋白的表达。
　　第二部分 野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2体外生长和体内生长的影响
　　1.Hep-2细胞感染重组腺病毒24h，48h，72h，96h后，Ad-p16组Hep-2细胞的增殖抑制率分别为3.003％±0.497(24h)，12.031％±1.946(48h)、24.857％±1.473(72h)和30.35％±1.916(96h)，与Ad-LacZ比较，均有显著性差异;
　　2.流式细胞术检测细胞凋亡率，Ad-p16组Hep-2细胞凋亡率从24h的9.99％增加到26.98％(48h)和37.87％(72h)，在Ad-LacZ组和Ad-p16组之间进行比较，细胞凋亡诱导率24h时无统计学差异，但48h和72h有明显的统计学差异;
　　3.电子显微镜下观察发现Ad-p16感染的细胞染色质浓缩和明显的凋亡小体。而Ad-LacZ感染的Hep-2细胞少见染色质浓缩和凋亡小体。
　　4.与Ad-LacZ比较，Ad-p16感染Hep-2细胞后24h，使其G0/G1期细胞明显增加(48.36％)，S期细胞明显减少(38.26％)，而G2/M期细胞无明显变化;
　　5.与Ad-LacZ组比较，促凋亡基因p53、Caspase-8和Bak在Ad-p16组的表达上调，抑凋亡基因Survivin和bcl-2的表达下调，均具有明显的统计学差异，而Bel-xl的表达无统计学差异;
　　6.与Ad-LacZ组相比较，细胞周期蛋白p21和cyclinD1基因在Ad-p16组的表达上调，有明显的统计学差异，而E2F2和CDK4基因的表达无统计学差异;
　　7.裸鼠移植瘤实验结果显示untreated组及Ad-LacZ组小鼠肿瘤生长迅速，且体积与时间呈一定线性关系，两组在各时间点瘤体体积对比，均无统计学差异。与Ad-LacZ组比较，Ad-p16治疗组的肿瘤体积在12天前均无统计差异，但16天开始，肿瘤生长缓慢，具有统计学差异，且24天出现肿瘤生长消退的趋势;
　　8.喉癌Hep-2细胞移植瘤组织Tunnel染色结果显示，untreated组Tunnel阳性细胞百分率为30.56％±1.842，Ad-LacZ组为34.44％±2.572，Ad-p16组为71.78％±3.244，可见Ad-p16组肿瘤组织的凋亡程度明显增高，与Ad-LacZ组比较，p＜0.0001。
　　第三部分 野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2与NK细胞之间相互作用的影响
　　1.用CCK8法检测NK细胞对Hep-2细胞的杀伤率，结果显示，与Ad-LacZ组对比，不同效靶比的条件下，NK细胞对Ad-p16组Hep-2细胞的杀伤效率均有不同程度的提高，且具有统计学差异;
　　2.流式细胞术检测结果显示，Ad-p16组Hep-2细胞表面NK细胞活化性受体NKG2D的配体MICA/B和ULBP2的表达均上调，与Ad-LacZ比较，均具有显著的统计学差异;
　　3.采用qRT-PCR检测结果显示，表达p16的Hep-2细胞可下调IL-10、TGF-β和IL-6的基因表达，上调IFN-γ的基因表达，与Ad-LacZ比较，均具有显著的统计学差异;
　　4.ELISA检测结果显示，Ad-p16组培养上清中TGF-β的浓度低于另外两组，且具有明显的统计学差异;
　　5.用不同组Hep-2培养上清孵育NKL细胞后，按照效/靶比4∶1的比例，利用CCK8法检测NKL的杀伤活性。结果显示，单纯Hep-2细胞培养上清孵育后的NKL细胞杀伤Hep-2细胞的效率为44.80％±1.277，Ad-LacZ处理组的为44.43％±1.241，二者之间无统计学差异。而Ad-p16组的为77.10％±1.850，与Ad-LacZ组比较，p＜0.0001。
　　6.Ad-LacZ组培养上清添加anti-TGF-β Ab以阻断TGF-β的作用，结果显示，阻断后NK细胞的杀伤活性由44.43％±1.241增加到58.33％±1.525，且具有统计学差异。Ad-p16组培养上清补充TGF-β蛋白，结果显示，补充后NK细胞的杀伤活性由77.10％±1.850减少到58.73％±2.554，且具有统计学差异。
　　结论:
　　1.人喉癌细胞系Hep-2细胞缺失p16蛋白的表达，而重组腺病毒Ad-p16感染Hep-2细胞后，p16蛋白在该细胞的表达率可高达95％左右，补充了Hep-2细胞缺失的p16蛋白，重组腺病毒Ad-p16可为下一步的实验研究提供良好的物质基础。
　　2.野生型p16蛋白在Hep-2细胞的表达可使该细胞体内外的生长均受到抑制;野生型p16蛋白可使Hep-2细胞停滞于G0/G1期，减少细胞进入S期，说明p16蛋白可通过调控细胞周期来发挥其抑瘤作用;野生型p16蛋白可促进Hep-2细胞的凋亡，且呈时间依赖性;电子显微镜显示存在经典的细胞凋亡形态;移植瘤组织Tunnel染色也显示p16蛋白可促进细胞的凋亡，表明p16蛋白促进肿瘤细胞凋亡是其发挥抑瘤作用的另一机制。
　　3.野生型p16蛋白在Hep-2细胞的表达，一方面，引起Hep-2细胞高表达NKG2D配体，使其对NK细胞的杀伤敏感性增加;另一方面，Hep-2细胞中细胞因子的表达发生改变，如下调TGF-β和IL-10，上调IFN-γ，进一步实验证实p16蛋白引发的TGF-β的下调可使NK细胞的杀伤活性得到提高。
　　意义:
　　通过本课题的研究，初步揭示了在p16蛋白抗肿瘤机制中，存在着两条不同的作用通路，即抑制肿瘤细胞自身的生长速度和促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。对这两条途径的关系，国内外鲜有研究，尚属于初步探讨，不过相信随着免疫学和基因治疗的发展，对于抑瘤基因的抗肿瘤机制的认识会越来越深入，将为肿瘤的免疫治疗开辟新的道路。

目录

声明

摘要

英文缩略语说明

第一部分 重组腺病毒载体的扩增及其感染人喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达情况

前言

材料与方法

结果

1 重组腺病毒扩增后滴度检测

2 重组腺病毒感染人喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达

讨论

小结

参考文献

第二部分 野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2体外生长和体内生长的影响

前言

1 p16蛋白与细胞周期

2 p16蛋白与细胞凋亡

材料与方法

结果

1 体外实验结果

2 体内实验结果

小结

参考文献

第三部分 野生型pl 6蛋白对人喉癌细胞Hep-2与NK细胞之间相互作用的影响

前言

材料与方法

结果

1 Ad-p16增加Hep-2细胞对NK细胞杀伤的敏感性

2 Ad-p16影响Hep-2细胞表面NK细胞受体配体的表达

3 Ad-p16影响Hep-2多种细胞因子的表达

4 表达p16的Hep-2细胞培养上清具有促进NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用

5．Ad-p16抑制Hep-2细胞TGF-β的分泌是增强NK细胞杀伤活性的重要因素

参考文献

结论及研究前景

攻读学位期间发表的学位论文和论著

致谢

外文论文一(已发表)

外文论文二(待发表)

学位论文评阅及答辩情况表