人脑胶质瘤MGMT表达及miR-4539对MGMT表达调控作用的研究

摘要

脑胶质细胞瘤是由于大脑中的胶质细胞癌变所引起的，在原发性的颅内肿瘤中最为常见，约占颅内所有恶性肿瘤的50％，发病率为3～10/10万，占全身恶性肿瘤的1％～3％，病人死亡率较高。目前胶质瘤主要通过手术切除，随后放射治疗和替莫唑胺(TMZ)化疗联合治疗。TMZ是新一代的烷化剂类抗肿瘤药物，能够穿过血脑屏障并通过产生引发DNA错配修复途径的无效循环的甲基加合物而诱导肿瘤细胞凋亡。目前临床使用TMZ治疗胶质瘤的效果并不能达到令人满意的程度，主要的原因是部分胶质瘤患者对烷化剂化疗药物存在耐药性。近来有研究表明，导致烷化剂类药物耐药主要的原因是DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)的存在。MGMT通过将烷基从DNA鸟嘌呤的O6位置转移到其半胱氨酸残基来逆转DNA烷基化过程，恢复肿瘤细胞的繁殖增生能力，胶质瘤具有升高的MGMT活性时通常显示对TMZ治疗的化学抗性。一些研究已经证实，当MGMT启动子处于甲基化状态时，能够使MGMT基因处于静止状态，进而阻止其所介导的DNA修复功能和从而增强胶质瘤对烷化剂的敏感性。MicroRNA(miRNA)通过与靶基因的非编码区结合而导致靶mRNA的降解或翻译过程的抑制，进而调控基因的表达，参与一系列生物学行为。
　　研究目的:检测MGMT在胶质瘤病例标本中的表达水平，分析MGMT表达水平与胶质瘤级别、胶质瘤大小之间的关系，探寻能够影响MGMT表达水平的MiRNA，并为缓解部分胶质瘤患者对烷化剂类药物耐药寻找新的作用靶点。
　　研究方法:山东大学齐鲁医院随机选择47例于2015年7月至2015年11月接受手术切除的患者神经胶质瘤组织样本。所有样品通过独立的病理学检查鉴定为神经胶质瘤。每例样本分为两部分，一部分用于组织切片进行免疫组织化学染色检测MGMT表达量，另一部分用于提取RNA。根据WHO中枢神经系统肿瘤分级标准（2007年），将取得的胶质细胞瘤标本分为Ⅰ-Ⅳ级，其中低恶性组包含Ⅰ级与Ⅱ级，高恶性组包含Ⅲ级与Ⅳ级。选用患者颅脑磁共振横断位液体衰减反转恢复(fluidattenuated inversion recovery，FLAIR)序列成像测量最大直径。免疫组化中采用H评分法对MGMT表达情况进行定量。使用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析，MGMT表达阳性率与胶质瘤级别及大小的关系采用x2检验。miRNA及mRNA表达水平计算采用2^-△△CT方法计算，实验组与对照组两组间的比较采用t-检验法，p＜0.05为具有显著统计学差异。利用miRNA数据库(TargetScan database; http://www.targetscan.org/vert_61/)找出在MGMT3'UTR存在结合位点的miRNA，并进行细胞水平验证。对胶质瘤组织中MGMT与miRNA的表达量采用Westen blot及Real-Time PCR方法检测，明确两者表达关系。构建MGMT3'UTR荧光素酶野生型及突变型载体，进行双荧光素酶检测，明确两者调控关系。细胞水平验证，选取MGMT表达相对较高的胶质瘤细胞系转入miRNA mimics及inhibitor，检测MGMT表达变化情况。功能验证，对转入miRNAmimics及inhibitor的细胞进行耐药性实验，利用cck-8，凋亡蛋白表达情况及流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。探讨miRNA-4539对MGMT的调控作用，及这种作用在胶质瘤中的表达与替莫唑胺(TMZ)耐药之间的关系。
　　结果:1.MGMT在胶质瘤组织中的表达量与胶质瘤病理级别及胶质瘤大小没有相关关系;2.MGMT与MiRNA-4539在胶质瘤组织中表达呈负相关关系;3.MiRNA-4539能够作用于MGMT3'UTR，抑制其表达;4.在体外细胞水平，转入MiRNA-4539 mimics时MGMT表达下降，转入MiRNA-4539 inhibitor时MGMT表达升高;5.在体外细胞水平，转入MiRNA-4539 mimics时，胶质瘤细胞对TMZ的耐药性减低，而转入MiRNA-4539 inhibitor时则相反，TMZ耐药性增加。
　　结论:MiRNA-4539在体外试验中可以抑制MGMT表达并改善胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 MGMT在胶质瘤中的表达及意义

资料与方法

结果

讨论

第二部分 MicroRNA-4539抑制MGMT表达并提高胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的研究

1 材料与方法

结果

讨论

结论

附表附图

参考文献

致谢