DNA损伤修复基因MCM8在原发性卵巢功能不全发病中的作用及机制研究

摘要

[背景]原发性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency，POI）又称为卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是严重影响育龄期女性身心健康的常见生殖内分泌疾病之一。其临床特征主要表现为原发性闭经或40岁之前继发性闭经，并伴有高促性腺激素以及雌激素水平低下等一系列围绝经期表现。POI病因高度异质，已知病因包括染色体异常、基因突变、免疫因素、医源性损伤以及环境因素等，其中遗传学因素约占20％-25％。迄今为止，仅有少数基因通过功能研究证实其致病性，包括位于X染色体的BMP15、PGRMC1和FMR1基因，以及常染色体的FSHR、GDF9、NR5A、NOBOX、FIGLA和FOXL2等基因。近年来，国内外学者发现DNA损伤修复相关基因与女性早绝经、卵巢储备功能下降以及POI的发生密切相关，其中，微小染色体微粒蛋白8(Minichromosomemaintenance complex component8，MCM8)基因是研究热点之一。
　　微小染色体微粒蛋白8是微小染色体微粒蛋白(Minichromosomemaintenance complex component，MCM)家族成员，参与DNA复制、减数分裂和DNA双链断裂同源重组修复过程。Mcm8基因敲除雌鼠表现为卵母细胞减数分裂障碍，卵泡进行性减少，卵巢萎缩。Aleksandar Rajkovic等利用全外显子组测序在POI家系中发现MCM8纯合错义突变，并证实该突变破坏了染色体稳定性。但MCM8在散发性POI患者中的致病性尚未见报道。因此，我们在192例散发性POI患者中进行基因突变筛查，以明确MCM8与散发性POI相关性和致病机制。
　　[目的]探讨MCM8与中国汉族散发性POI的相关性，并阐明致病机制。
　　[方法]选择192例中国汉族散发性POI患者为病例组。入选标准包括:a.年龄在20-35岁;b.原发性或继发性闭经;c.促卵泡生成素(FSH)＞40IU/L;d.染色体核型为46，XX;e.无POI家族史。排除标准包括:既往有免疫性疾病、盆腔感染、卵巢手术、放化疗、其他医源性损伤等。同时收集312例中国汉族健康女性作为对照组（包括192例年龄匹配、月经规律的育龄期女性以及120例年龄45岁以上、FSH＜12 IU/L、双侧卵巢窦状卵泡数≥3个、月经规律的健康女性）。
　　提取病例组和对照组女性外周血全基因组DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增MCM8基因的19个外显子及相应侧翼序列，进行直接测序。将测序结果与Ensembl提供的正常碱基序列进行序列比对。针对新发现的变异类型设计DNA损伤修复实验，验证新发MCM8基因变异的致病性及机制。
　　[结果]测序结果发现2个新发错义突变:c.A950T(p.H317L)和c.A1802(p.H601R)，6个已知单核苷酸多态位点(Single-nucleotide polymorphisms，SNP)(5个非同义SNP: rs236110、rs116926921、rs58487183、rs16991591、rs61752028，1个同义SNP rs3761873)。DNA损伤修复实验结果显示:与野生型HeLa细胞(WT)相比，过表达p.H317L以及p.H601R突变型MCM8的HeLa细胞(MT)对DNA损伤诱导剂丝裂霉素C(MMC)更为敏感，表现为磷酸化组蛋白H2A(γH2AX)表达水平明显上调。MMC处理后更换新培养基继续培养2小时，WT和p.H601R突变体γH2AX的表达水平明显降低或消失，而p.H317L突变体γH2AX的表达水平却没有明显变化，提示突变p.H317L和p.H601R均影响了MCM8的DNA损伤修复功能，而p.H317L对MCM8蛋白DNA损伤修复能力影响更为显著。
　　[结论及意义]首次在中国汉族散发性POI患者中发现MCM8基因突变，并通过功能实验证实突变p.H317L和p.H601R型MCM8 DNA损伤修复功能受损，由此推测该基因突变导致的卵母细胞减数分裂障碍可能是POI的致病机制之一。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

研究材料和方法

研究对象

主要试剂

主要仪器

MCM8基因信息

实验方法

结果

1．MCM8基因测序结果分析

2．细胞功能实验结果分析

讨论

附录和附图

致谢

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参考文献

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