Alpha-防御素(α-Defensin)作为诊断关节置换术后假体周围感染生物标记物的研究

摘要

研究背景
　　人工关节置换假体周围感染(Periprosthetic joint infcction，PJI)是关节置换术后灾难性的并发症，由于其复杂性，在临床上是难以避免的并且常常导致不良的临床预后。其治疗往往需要2阶段的关节翻修，这会给患者和医疗体系带来更多的经济压力和负担，而且据报道表明翻修失败率一直在增加，这最终将导致治疗的失败。如何及时准确的诊断假体周围感染，对于避免诊断假阳性的病例术中进行不必要的2阶段翻修和防止在假阴性病例中仅仅进行1阶段修复而导致植入物再植失败都是非常重要的。
　　然而，在大部分患者中，关节假体周围感染的诊断不是显而易见的，其症状常常没有特异性，部分发生假体周围感染的病人没有明显的临床表现，因而其诊断一直是临床上极具挑战性的难题。预防是减少这种灾难性的并发症发生的首要的也是最好的方法。美国肌肉及骨骼感染学会(Musculoskeletal Infection Society，MSIS)已经发现了这一临床诊断上的缺陷所在，并且根据临床症状表现、实验室检查及组织病理学提供了关节假体周围感染的定义及诊断标准，但其需要1-2个主要指标或4-6个次要指标，虽然可以用于临床，但其使用复杂且耗时长，不易于早期及时诊断及发现。关节置换术后假体周围感染是影响手术成功的重要因素之一，在第一次进行关节置换患者人群中，发生于髓关节以及肩关节的感染的概率通常情况下不超过1％，发生于膝关节的感染概率一般不超过2％，而发生于肘关节感染率则通常较高，一般约为9％。对于进行关节翻修的患者，其感染率则远远高于一般患者。这种感染存在一定的致死率，据报道因感染而引起的患者的死亡率大概在1.0％～2.7％。诊断的理想方法是寻找一种可单独并具有高度检测敏感性和特异性而且容易掌握及理解的方法。目前，临床医生及科学家致力于通过检测关节腔液中的生物标记物(biomarker)的方法来开发有效且简单的诊断关节周围感染的诊断工具。但是目前为止，仍旧没有一种灵敏度及准确度均能被临床所接受的生物标记物作为早期诊断的指标。
　　防御素(defensins)是固有免疫系统的一部分，是一种具有抗病毒、细菌、真菌等微生物的的多肽，其功能主要为可以直接中和入侵的病原微生物。α-防御素(α-defensin)主要存在于分叶核中性粒细胞及包括单核中性粒细胞、淋巴细胞等细胞内，在自然杀伤细胞中也有一定表达。在分叶核中性粒细胞中，α-防御素在对被吞噬的病原体氧化应激依赖性杀伤作用中发挥重要作用。而且，α-防御素具有广谱的抗微生物作用，对多种革兰阴性及阳性菌均有杀伤作用。其在抗微生物中的重要作用表明，α-防御素在关节腔液中的表达也许可以作为假体周围感染的诊断生物标记物。但是就这一点来说，α-防御素检测在诊断假体周围感染时仍没有独立机构确认，并且在不同报道中其敏感性及准确度均有一定争议。
　　目前，假体周围感染已有大量的体外研究结果，但体外研究结果仍旧难以替代体内情况，这就要求我们去建立高效且有用的动物模型，将各种体外研究成果向临床转化。为研究α-防御素检测在诊断假体周围感染的诊断价值，本实验采用兔制备人工膝关节假体置换模型，通过向关节腔内注射不同浓度的金黄色葡萄球菌，在不同时间点观察关节感染情况和关节腔积液量，确定了建立假体周围感染的合适菌量及处理时间。利用上述方法制备关节置换术后假体周围感染的动物模型来检测α-防御素在诊断中的准确性和特异性，并且和现有的常用实验室检查相比较，特别是白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(PMN％)、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)，从而用于探讨α-防御素对假体周围感染的诊断价值。
　　由于人工关节置换术后假体周围感染的诊断方法往往存在敏感性或特异性达不到要求或耗时较长等各种局限，同时由于近年来抗生素滥用严重，细菌在关节腔内形成生物膜等，给诊断带来了巨大的困难。α-防御素作为一种重要的抑菌肽，在病原体感染后由分叶核中性粒细胞及其他多种细胞分泌到关节液里面，然后整合到病原菌细胞膜上并快速杀死病原菌，从而给免疫系统提供抗菌支持，完成自发和适应性免疫反应这一过程。α-防御素的检测可能成为一种新的现代分了生物学手段来攻克这道难关。
　　第一部分关节置换术后适合关节腔抽液假体周围感染动物模型的建立
　　目的：目前关于利用金黄色葡萄球菌构建关节置换术后假体周围感染动物模型的研究已经有部分报道，但细菌的具体用量、感染时间、产生的关节液量、构建模型的标准和实验或临床应用的方向等方面仍旧没有明确、统一的说明。本研究的目的在于通过优化细菌用量及感染时问等构建模型中的关键因素，建立关节置换术后假体周围感染的模型，寻找在不同实验条件下的关节感染状态和满足关节液抽取量等条件的最优组合，探讨该模型建立的可行性和应用价值。
　　方法：选取健康中国白兔64只，由同一研究员在兔左膝关节处做使用钛合金螺钉行膝关节置换术，术后即刻行X线检查，证实植入物位置良好。之后随机分入对照组和实验组(共4组，对照组A给予生理盐水，实验组B、C、D分别给予金葡菌液1ml，浓度分别为0.5×104cfu/ml，0.5×105c fu/ml，0.5×106cfu/ml)。之后通过进行大体评分、细菌培养鉴定、死亡率、感染率、关节腔穿刺抽液计量等检测方法，按照MSIS的诊断标准和感染分级评分进行评分并判定感染，验证模型建立的有效性、安全性和稳定性。
　　结果：经分组基线齐性检验，四组之间在实验动物的体重、年龄、性别比例上没有明显的差异。在注射生理盐水或金黄色葡萄球菌后，通过MRI检测关节腔积液量，以横径×长径的值反应关节腔积液的量:注射后第一周MRi测量关节腔积液量（A组无法检测到，B组0.57±0.21，C组3.05±0.51，D组3.27±0.38），C组明显高于B组(p＜0.001)，D组也明显高于B组(p＜0.001)，但C、D两组之间没有明显差异(p=0.38);注射后第二周MRI测量关节腔积液量（A组无法检测到，B组1.58±0.32，C组6.18±0.66，D组6.25±0.58），C组明显高于B组(p＜0.001)，D组也明显高于B组(p＜0.001)，但C、D两组之间没有明显差异(p=0.82)。实际抽取关节腔积液量，注射后第一周抽取关节腔积液量（A组难以抽取，B组0.12±0.12ml，C组0.25±0.32ml，D组0.37±0.15ml），C组明显高于B组(p＜0.001)，D组也明显高于B组(p＜0.001)，但C、D两组之间存在边界性差异(p=0.042);注射后第二周抽取关节腔积液量（A组难以抽取，B组0.14±0.22ml，C组0.76±0.11ml，D组0.67±0.11 ml），C组明显高于B组(p＜0.001)，D组也明显高于B组(p＜0.001)，但C、D两组之间无统计学差异(p=0.15)。A组未出现实验动物死亡也未出现假体周围感染，B、C、D三组感染模型构建成功率分别为62.5％，100％，100％。尽管C、D两组的感染率均为100％，但C组死亡率为0％，而D组死亡率则为18.75％。同时，实验结果显示，在感染后第二周关节液量足够进行检测，且能保证大部分实验动物存活状态良好。
　　结论：本研究发现，家兔膝关节腔内注射0.5×105cfu/ml的金黄色葡萄球菌1ml能够成功构建稳定的关节置换术后假体周围感染动物模型，并且在感染后的两周可以获得合适的关节腔积液量用于假体周围感染的体内实验研究。
　　第二部分 Alpha-防御素在关节置换术后假体周围感染诊断中的价值
　　目的：本研究通过兔关节置换术后假体周围感染模型探讨α-防御素在关节置换术后假体周围感染诊断中的价值，明确诊断阈值，并与其他诊断指标进行比较，为α-防御素在临床上的应用提供实验基础。
　　方法：将90只白兔随机分为三组:A组为空白对照组，B组为实验对照组，C组为术后感染组。模型制备成功后两周，耳缘静脉取血用于白细胞、中性粒细胞百分比、C反应蛋白、血沉等常规实验室指标检测。空气栓塞处死实验动物后，C组关节腔穿刺抽取关节液样本， A、B组穿刺入关节腔后注射1ml无菌生理盐水，灌洗后再抽出以获取样本。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测α-防御素在关节腔液中的表达，并分别取关节腔积液、关节内滑膜组织、假体周围炎性肉芽组织和假体螺钉行细菌培养及检测，利用ROC曲线和Pearsoncorrelation分析来评估α-防御素作为生物标记物对关节置换后假体周围感染的诊断价值。
　　结果：A、B、C三组每组各30只动物。根据培养结果，C组动物关节腔组织细菌培养可见大量金黄色葡萄球菌生长，A、B两组培养均为阴性，证明引起感染的为金黄色葡萄球菌，利用MSIS标准判定C组动物假体周围感染模型建立成功。术后感染组的白细胞数明显高于实验对照和空白对照组（A组6.59±1.2×109/L，B组10.15±1.07×109/L，C组11.76±1.55×109/L，P＜0.001），敏感性及特异性分别为96％及67％。中性粒细胞百分比在三组之间也存在明显差异（A组41.78±10.45％，B组56.00±11.09％，C组69.17±10.26％，p＜0.001），诊断的敏感性和特异性分别为100％及64％。血沉术后感染组也明显高于其他两组（A组2.94±0.50mm/h，B组13.53±0.91mm/h，C组17.48±2.71mm/h， P＜0.001），诊断的敏感性及特异性分别为82％及67％。CRP在三组之间也存在明显差异（A组1.67±0.15mg/L，B组1.82±0.15mg/L，C组2.20±0.27mg/L，p＜0.001），诊断的特异性及敏感性分别为82％及87％。α-防御素的检测结果在C组中明显高于另外两组(A组36.56±0.87ng/μL，B组37.91±1.02 ng/μL，C组59.15±5.64 ng/μL，p＜0.001)。α-防御素在诊断的特异性及敏感性上分别达到100％及95％，远远高于其他指标。
　　结论：α-防御素作为关节置换术后假体周围感染的诊断指标具有极高的敏感性(100％)及特异性(95％)，是一种理想的假体剧围感染的诊断标准，但其是否受其他因素影响，仍需其他疾病动物模型及临床试验验证。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 关节置换术后适合关节腔抽液假体周围感染动物模型的建立

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

附图附表

参考文献

第二部分 Alpha-防御素在关节置换术后假体周围感染诊断中的价值

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

附图附表

参考文献

致谢

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综述 人工关节置换术后假体周围感染(PJI)的诊断新进展