剪接因子USP39促进卵巢癌恶性行为的作用及机制

摘要

研究背景：
　　卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，临床上缺乏实用的早期预防和治疗手段，约70％的患者在就诊时已为晚期，而且预后较差，2016年统计的5年生存率不到27％;因此美国政府发起的癌症基因组图谱(TCGA)计划将其列为首批研究的三大肿瘤之一。阐明卵巢癌转移、复发和耐药的分子机制，寻找有效的治疗靶点成为提高卵巢癌患者生存率的关键，也是卵巢癌研究面临的重要课题。选择性剪接(Alternative splicing，AS)是指将同一种前体mRNA剪接成多种不同的成熟mRNA剪接变异体，进而产生具有不同结构和功能蛋白质的过程。选择性剪接参与细胞的生长、分化、凋亡等重要生物学过程，与人类遗传病、肿瘤等疾病的发生密切相关。我们利用表达谱结合TCGA数据分析发现在卵巢癌中表达上调的10个通路中剪接体通路排名第一位，进一步利用表达谱分析了134个主控剪接因子，发现有33个在卵巢癌中表达显著升高。USP39是我们发现的在高级别浆液性癌中显著高表达的剪接因子，查阅文献发现USP39在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多种癌组织中高表达并显著促进肿瘤细胞的生长。USP39作为剪接体复合物的分子之一，参与招募tri-snRNP到剪接体复合物中发挥作用，参与mRNA剪接的调控。USP39在斑马鱼中参与到RB1(Retinoblastoma1)剪切的调控;USP39通过选择性剪接调控Aurora B的表达而影响U2OS细胞的分裂过程。我们前期实验发现USP39在高级别浆液性卵巢癌（high grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）组织中高表达，然而USP39在卵巢癌中的生物学功能及作用机制未见报道，USP39通过AS调控的选择性剪接事件及关键下游分子网络需要进一步研究明确。
　　研究目的:
　　本研究拟明确USP39在高级别浆液性癌中的表达及临床意义;研究USP39对卵巢癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征的影响;筛选和鉴定USP39调控的选择性剪接事件及下游关键分子。
　　研究方法:
　　利用表达谱芯片分析高级别浆液性癌组织(n=6)、正常输卵管伞组织(n=6)中的差异基因表达;进一步利用生物信息学分析表达谱数据及TCGA数据;Real-time PCR、免疫组化检测正常及浆液性癌组织中USP39的表达。利用逆转录病毒和慢病毒载体构建过表达和敲低USP39的卵巢癌细胞系，利用平板克隆、Transwell、流式细胞术检测细胞周期验证USP39的功能。分析USP39敲低细胞及对照细胞选择性剪接表达谱筛选USP39下游调控的靶基因，并用qPCR进行验证。在过表达和敲低USP39的细胞中检测HMGA2的表达情况，用Northern blot、小基因模型(minigene)等方法研究USP39对HMGA2的调控。
　　研究结果:
　　1、USP39在高级别浆液性癌组织中显著高表达并与患者预后相关
　　我们利用表达谱结合TCGA数据库分析发现在卵巢癌中表达上调的10个通路中剪接体通路排名第一位，进一步利用表达谱分析了134个主控剪接因子，发现有33个在卵巢癌中表达显著升高。USP39是我们发现的在高级别浆液性癌中显著高表达的剪接因子（表达谱中上调7.3倍，蛋白质组上调3.4倍）;TCGA数据分析表明，USP39在高级别浆液性癌(n=585)中明显高于正常组织(n=8)(P＜0.0001);qPCR及免疫组化验证也发现USP39在卵巢癌中的表达水平明显高于正常输卵管伞。利用TCGA数据进行预后分析发现，USP39高表达的患者预后较差(P＜0.05)。
　　2、USP39促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为
　　为阐明USP39在高级别浆液性癌中高表达的生物学意义，我们建立了USP39过表达和低表达细胞系，并进行了系列体外实验。平板克隆形成实验结果，过表达USP39的A2780、HO8910细胞的克隆形成数目和大小明显高于对照组，敲低USP39的A2780、SKOV3细胞的克隆形成数目和大小低于对照组;细胞周期分析显示敲低USP39使细胞停留在在Go/G1期，Westernblot检测细胞周期相关蛋白发现敲低USP39的细胞p53、p27表达上调，CyclinD1表达下调。以上实验表明USP39能够显著促进卵巢癌细胞的增殖能力。
　　为进一步研究USP39影响卵巢癌细胞的恶性行为，我们进行了Transwell侵袭实验，结果显示过表达USP39的A2780、HO8910细胞的穿壁细胞数目高于对照组，敲低USP39的A2780、SKOV3细胞的穿壁细胞数目低于对照组。随后我们利用Western blot检测了上皮细胞-间质转化(EMT)相关标记物，结果显示过表达USP39的细胞β-catenin、Vimentin、Snail、Slug上调;敲低者结果相反。说明USP39促进卵巢癌细胞的侵袭力和EMT进程。
　　3、USP39调控的选择性剪接事件及关键靶基因
　　利用建立的USP39低表达及对照细胞系进行选择性剪接表达谱芯片分析，发现敲低USP39引起了2500多个选择性剪接事件的变化，影响最多的选择性剪接方式是盒式外显子，另外还影响到可变的5'端或3'端及内含子保留，而对不相容性剪接几乎没有影响。课题组进一步筛选出剪接指数较高（绝对值大于3），而且在USP39敲低的细胞中表达下调的的肿瘤相关基因进行验证。发现PARP1、ZEB1、HMGA2、RAD51、MDC1基因的表达在USP39敲低细胞中mRNA的表达水平显著降低。
　　4、USP39通过选择性剪接调控HMGA2基因的表达
　　我们以前的研究结果显示HMGA2在卵巢癌中高表达并于患者预后相关，HMGA2显著促进卵巢细胞的侵袭转移能力。因此，我们选择HMGA2做进一步的研究。qPCR及Western-blot结果表明，HMGA2在USP39过表达的细胞中表达升高，在敲低USP39的细胞中表达下降。利用TCGA数据库分析发现USP39和HMGA2相关系数为0.3167，为中度相关(P＜0.001)。
　　通过构建Mingene（野生型和突变型载体），共转染Minigene及发现在过表达USP39的293T细胞中HMGA2 minigene M0的转录本发生了改变，USP39过表达会促进短的转录本增多，USP39对HMGA2转录本的调控属于3'剪接位点选择方式，USP39调控HMGA2 minigene依赖内含子3的3'剪接位点的强弱。
　　结论：
　　1.USP39在高级别浆液性癌组织中显著高表达并与患者预后相关。
　　2.USP39促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为。
　　3.USP39调控多个选择性剪接事件的变化及关键肿瘤相关基因的表达。
　　4.USP39对HMGA2转录本的调控属于3'剪接位点选择方式，USP39过表达会促进短的转录本增多，并上调HMGA2蛋白的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1、USP39在高级别浆液性癌组织中显著高表达并与患者预后相关

2、USP39促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为

3、USP39调控的选择性剪接事件及关键靶基因

4、USP39通过选择性剪接调控HMGA2基因的表达

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文和参与课题情况