基于秀丽隐杆线虫的抗脂肪堆积益生菌筛选及四株新物种鉴定

摘要

肥胖问题日益加剧，威胁着人类的健康。益生菌的作用逐渐被人们重视，而筛选抗脂肪堆积的益生菌有望应用于减缓肥胖问题。目前使用的益生菌主要是乳酸菌，而更多的益生菌有待于进一步发掘。海洋中微生物多样性非常丰富，可以作为益生菌的来源。本文用从海洋生物牡蛎的内脏中分离到的海洋菌以及从泡菜中分离到的乳酸菌喂养秀丽隐杆线虫，对抗脂肪堆积益生菌进行筛选。另外，海洋中存在很多潜在新菌，本文对四株海洋新菌进行了多相分类，丰富了微生物资源。本论文取得如下成果:
　　筛选到一株能使线虫脂肪堆积减少的海洋菌ML182（Olleya marilimosa）。以秀丽隐杆线虫为筛选模型，选取从采集于威海国际海水浴场(37°31′51.09″N，122°2′43.76″E)的牡蛎内脏中分离到的32株海洋细菌、从泡菜样品中分离到的18株细菌（其中有6株乳酸菌）、海洋微生物资源库中的8株细菌和本文鉴定的4株菌为实验对象，经喂食研究发现，筛选自牡蛎内脏中的海洋菌ML182（Olleyamarilimosa）能够使线虫体内脂肪堆积减少，灭活的海洋菌ML182也能起到同样的效果。因此选取该菌为候选益生菌。
　　对秀丽隐杆线虫喂食海洋菌ML182（Olleya marilimosa）后体内生理生化反应和脂肪合成与分解相关基因进行了分析。检测分析表明，海洋菌ML182对秀丽隐杆线虫各项生命体征无影响，无毒性，仅使得秀丽隐杆线虫体内脂肪堆积减少。RT-qPCR结果显示，秀丽隐杆线虫体内与脂肪合成有关的酶基因fasn-1、pod-2、fat-5、fat-6和fat-7下调，与脂肪酸β-氧化有关的酶acs-2上调，代表喂食海洋菌ML182的线虫脂肪合成减少。
　　完成了四株海洋新菌的多相分类，确定了四株菌的分类地位。
　　YH6T是从中国威海沿海沉积物中分离得到的一株新的兼性厌氧菌，为革兰氏阴性。唯一呼吸醌醌型为Q-8，主要脂肪酸(＞10％)为C16:0和summed feature3(C16:1ω7c/iso-C15:02-OH)。极性脂成分为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、心磷脂和其他一些未知的脂质（磷脂、脂和磷氨基脂）。基因组的G+C含量为46.5 mol％。系统发生学上和YH6T最相近的物种为Vibrio variabilis（16S rRNA序列有92.99％相似性），其次为Paramoritella alkaliphila(92.55％)、Pseudoalteromonas aurantia(92.20％)和Pseudoalteromonas citrea(92.20％)。系统发生学分析以及生理生化特征表明，YH6T代表γ变形菌纲，交替单胞菌目的一个新属。建议命名为象牙白运动单胞菌（Motilimonas eburnea gen.nov.，sp.nov.），模式菌株为YH6r(=KCTC42594 T=MCCC lH00122T)。
　　017T是以中国海南省陵水县海岸的芋根江蓠为材料，分离得到的一株新的兼性厌氧菌，呈杆状，革兰氏阴性。对017T16S rDNA进行分析显示，017T与Teredinibacter turnerae T7902T相似性最高，为94.4％。017T主要极性脂为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、氨磷脂及一些其它未知脂类。主要脂肪酸(＞10％)为C16:0、C18:1ω7c、 summed feature3(C16:1ω7c/iso-C15:02-OH），含有唯一呼吸醌Q-8。017T的G+C含量为40.2 mol％。16S rDNA序列分析及生理生化特征表明017T是纤维弧菌目，纤维孤菌科的新属。命名为居红藻裂解琼胶菌(Agarilytica rhodophyticolagen.nov.，sp.nov.)，模式菌株为017T(=KCTC42584T=MCCC lH00123T)。
　　菌株WDS2A16aT是从文登盐场分离得到的一株革兰氏阴性菌。WDS2A16aT的极性脂组分包括2种未知的磷脂(phospholipid，PL)、2种未知的氨基脂（Aminolipid，AL）和5种未知的脂质(lipid，L)。WDS2A16aT的DNA G+C含量为47.8 mol％。对16 SrRNA基因序列(1457 nt)进行比对分析表明与WDS2A16aT最为相近的菌株为Methylobacter marinus(90.61％)。WDS2A16aT代表γ变形菌纲的一个新属将其命名为盐场喜盐菌(Salinibius halmophila gen.nov.，sp.nov.)。模式菌株为WDS2A16aT(=KCTC52225T=MCCC lH00139T)。
　　菌株E85T是从文登盐场沉积物中分离到的一株革兰氏阴性菌。对16SrRNA基因序列(1461nt)进行比对分析表明与E85T最为相近的菌株为Spiribactersalinus(97.26％)。E85T的16S rDNA与邻近菌株的相似度都低于98％，而且发育树显示E85T形成了一个独立的分枝。综合表型、分子进化分析、生理生化分析结果，认为E85T代表一个新的物种，并建议将其命名为喜盐螺旋杆菌（Spiribacter halobium sp.nov.），模式菌株为E85T。

目录

声明

摘要

缩略词

1．1 肥胖的现状及危害

1．2 益生菌及其与肥胖的关系

1．3 秀丽隐杆线虫的模式生物作用

1．3．1 秀丽隐杆线虫

1．3．2 秀丽隐杆线虫作为模式生物的优势

1．3．2 秀丽隐杆线虫作为模式生物在抗肥胖研究中的应用

1．4 海洋微生物资源的开发与应用

1．5 立题依据

第二章 用于益生菌筛选的细菌的分离

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验样品

2．1．2 培养基与溶液

2．1．3 实验试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品处理

2．2．2 样品的稀释涂布及培养

2．2．3 菌落的分离纯化

2．2．4 基于16s RNA的菌株鉴定

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 基于秀丽隐杆线虫模型的抗脂肪堆积益生菌的筛选

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 培养基与溶液

3．1．3 实验试剂

3．1．4 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 线虫的培养和传代

3．2．2 线虫的保存与复苏

3．2．3 线虫的同步化

3．2．4 线虫的脂肪染色

3．2．5 菌株对秀丽隐杆线虫生命体征的影响

3．2．6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法

3．2．7 统计分析

3．2．8 实验设计

3．3 结果和讨论

3．3．1 对线虫的脂肪染色结果

3．3．2 菌株对秀丽隐杆线虫生命体征的影响

3．3．3 RT-qPCR方法检测喂食海洋菌ML182对线虫肥胖基因表达的影响

3．4 总结

第四章 四株变形菌门海洋新物种的鉴定

4．1．实验材料

4．1．1 样品和菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 实验试剂

4．1．4 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 菌株的分离、培养与保藏

4．2．2 菌株的表型与生理生化特征的测定

4．2．3 菌株G+C含量的测定、16sRNA基因克隆测序及发育分析

4．2．4 化学组分测定

4．3 实验结果

4．3．1 象牙白运动单胞菌(Motilimonas eburnea gen．nov．，sp．nov．)YH6T的多相分类

4．3．2 居红藻裂解琼胶菌(Agarilytica rhodophyticola gen．nov．，sp．nov．)017T的多相分类

4．3．3 盐场喜盐菌(Salinibius halmophila gen．nov．，sp．nov．)WDS2A16aT的多相分类

4．3．4 喜盐螺旋杆菌(Spiribacter halobium sp．nov．)E85T的多相分类

总结与展望

参考文献

致谢

资助情况

硕士期间撰写和发表的学术论文目录