白藜芦醇依次诱导复制压力和氧化压力驱动p53-CXCR2通路介导的肿瘤细胞衰老

摘要

白藜芦醇主要存在于葡萄和红葡萄酒中，也存在于其他植物及果实中，例如花生，蔓越橘，开心果，蓝莓和越桔。现在已经有这种化合物的纯化制剂和膳食补充剂。白藜芦醇具有广泛的益处，包括抗衰老，抗血小板聚集，抗氧化，抗炎，降血糖和抗癌。
　　白藜芦醇抗衰老的作用引起广泛的关注。已有研究表明白藜芦醇的抗氧化性和激活SIRT1的功能可能介导了其抗衰老的作用。从线虫到哺乳动物，都有关于白藜芦醇抗衰老作用的报道。但是近年来也有研究证明白藜芦醇可以通过升高活性氧(ROS)和诱导DNA损伤导致肿瘤细胞衰老，所以白藜芦醇在细胞水平上的促衰老或抗衰老的作用及其机制还不完全明确。
　　关于白藜芦醇抗氧化和促氧化的作用存在争议。经典的观点认为白藜芦醇是一个强大的抗氧化剂，由于其能减少ROS的产生和上调抗氧化系统的功能，包括还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶。然而，对癌细胞的研究发现，白藜芦醇还能破坏细胞抗氧化系统，导致氧化压力增加，进而抑制细胞增殖或引起细胞凋亡。另外，有研究显示白藜芦醇通过诱导ROS的产生导致内皮细胞的早衰。我们对白藜芦醇如何导致这种“氧化二元性”的机制知之甚少。
　　另外有很多研究表明白藜芦醇通过抑制NF-κB和NLRP3发挥抗炎的作用，预防很多疾病的发生。但是也有研究表明白藜芦醇通过ERK，p38和Akt信号通路上调Ⅱ型胶原和COX-2表达，具有促炎的作用。白藜芦醇是如何发挥促炎作用的及抗炎和促炎之间的决定因素还不清楚。炎症和氧化应激是密切相关的病理生理过程，都参与许多慢性疾病的发生。白藜芦醇的促氧化和促炎效应之间如何关联也不明确。
　　以上研究表明白藜芦醇具有抗衰老和促衰老、抗氧化和促氧化及抗炎和促炎的作用。我们以U2OS成骨肉瘤细胞为主要模型，研究了白藜芦醇诱导细胞衰老的作用及机制，得到以下五部分结果:
　　第一部分白藜芦醇诱导细胞S期停滞、DNA损伤应答及细胞的衰老
　　许多研究表明白藜芦醇具有抗肿瘤的作用。在本部分结果中我们检测了白藜芦醇对U2OS细胞的毒性效应。MTT实验结果显示白藜芦能抑制U2OS细胞的增殖，并具有浓度依赖性。流式细胞术检测表明经白藜芦醇处理的U2OS细胞，S期比例数明显升高（S期停滞），说明存在复制压力。我们检测了双链断裂的标志物γ-H2AX，结果发现白藜芦醇导致了DNA损伤，呈剂量依赖性。同时白藜芦醇激活了DNA损伤应答的主要调控蛋白ATM，此外复制压力的标志Chk1磷酸化也升高了。白藜芦醇长时间处理U2OS细胞能导致U2OS细胞衰老，而且衰老的细胞依然是S期比例数较高。但是只有高浓度白藜芦醇（≥10μM）能诱导U2OS细胞S期停滞和细胞衰老，低浓度的白藜芦醇没有这种作用。为了证明白藜芦醇诱导肿瘤细胞衰老这一现象的普遍性，我们用不同浓度的白藜芦醇处理人正常的成纤维细胞(NHF)和人的肺癌细胞(A549)，结果和U2OS细胞中的结果一致，表明白藜芦诱导肿瘤细胞衰老的现象是普遍的。此外白藜芦醇还能部分缓解H2O2诱导的U2OS和NHF的衰老，说明在不同的实验条件下白藜芦醇诱导衰老或抑制衰老的作用是不同的。
　　第二部分复制压力和氧化压力在白藜芦醇诱导细胞衰老中的作用及相互关系
　　白藜芦醇被报道作为核糖核苷酸还原酶的抑制剂起作用，其比羟基脲（一种常用的复制压力诱导剂）更有效地抑制小鼠核糖核苷酸还原酶的活性。第一部分的实验结果显示白藜芦醇确实引起了较明显的复制压力。已经有研究证明原癌基因诱导的细胞衰老是由复制压力介导并被外源性的核苷拯救。为检验白藜芦醇诱导的细胞衰老是否由复制压力介导，我们检测了外源核苷对细胞衰老的拯救效应。我们用核苷和白藜芦醇共同处理U2OS细胞，结果表明核苷能减少白藜芦醇导致的DNA损伤，并且5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)掺入实验表明核苷能缓解白藜芦醇导致的复制压力。同时，核苷降低了p-p53的蛋白水平。更重要的是核苷缓解了白藜芦醇导致的U2OS细胞的衰老，而且在A549和HT1080另外两种细胞中得到一致的结果。以上结果表明复制压力部分介导了白藜芦醇诱导的肿瘤细胞衰老。
　　有研究表明氧化压力在白藜芦醇诱导的结肠癌和内皮细胞衰老中起很重要的作用。为了验证氧化压力在白藜芦醇诱导的U2OS细胞衰老中的作用，用白藜芦醇处理U2OS细胞，流式检测ROS水平，结果白藜芦醇明显升高了ROS水平。更重要的是活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)能缓解白藜芦醇诱导的细胞衰老。因此，氧化压力也介导了白藜芦醇诱导的U2OS细胞的衰老。既然氧化压力和复制压力都能介导白藜芦醇诱导的细胞的衰老，我们下一步研究了这两种压力之间的相互关系及它们介导细胞衰老的相对贡献。从时间上来看，白藜芦醇处理U2OS细胞12小时已经出现了S期停滞，而ROS水平在白藜芦醇处理36小时才检测到明显的升高。此外，NAC和白藜芦醇共处理U2OS细胞24小时并不能缓解其诱导的S期停滞，只有在共处理72小时的时候S期停滞才有明显的缓解。我们在HT1080细胞中得到了类似的结果。以上实验表明S期停滞的发生先于ROS水平的升高。
　　之前有研究表明白藜芦醇通过上调NADPH氧化酶NOX1/4来诱导人内皮细胞的衰老。我们用NOX1/4的特异性抑制剂GKT137831(GKT)与白藜芦醇共处理，结果GKT部分缓解了白藜芦醇诱导的U2OS细胞的ROS水平的升高。RT-PCR检测白藜芦醇处理不同时间的NADPH氧化酶的表达水平，NOX1的mRNA水平在处理48小时明显的升高，NOX4水平没有升高，NOX2、NOX3、NOX5的水平在处理48小时有一定的升高。为了明确白藜芦醇诱导的氧化压力是否依赖于复制压力，我们用血清饥饿法处理NHF细胞48小时（此时大部分细胞都处于G0/G1期），然后再用白藜芦醇处理48小时ROS水平依然升高，表明ROS水平的升高并不依赖S期停滞或复制压力。然而NAC能部分缓解S期停滞，表明虽然ROS的升高晚于S期停滞，但是ROS的升高加强并维持了白藜芦醇导致的S期的停滞。我们也检测了存在其他氧化压力条件下白藜芦醇对ROS水平的影响，发现经H2O2处理的U2OS细胞中，白藜芦醇能部分降低H2O2导致的ROS水平的升高。在NHF细胞中的到了类似的结果，表明白藜芦醇发挥促氧化或抗氧化作用取决于实验条件。
　　第三部分 P53依赖的CXCR2上调介导细胞衰老并且具有抗凋亡的作用
　　我们之前的研究证明p53-CXCR2通路在压力诱导的NHF细胞和U2OS细胞衰老中起重要作用。因此我们猜想CXCR2上调也可能介导了白藜芦醇诱导U2OS细胞的衰老。经白藜芦醇处理的U2OS细胞， CXCR2表达明显升高，并具有浓度依赖性和时间依赖性。但是CXCR2水平的升高在第五天达到高峰随后又下降，p21和CXCR2有类似的趋势，说明衰老一旦形成只需要少量的效应蛋白维持即可。另外白藜芦醇能缓解H2O2导致的CXCR2水平的升高。CXCR2的表达上调依赖p53;敲除CXCR2后白藜芦醇诱导的U2OS细胞的衰老明显得到了缓解。以上结果表明p53-CXCR2通路在白藜芦醇诱导的细胞衰老中起到重要作用。
　　我们发现敲低CXCR2后白藜芦醇处理组与对照相比凋亡比例明显增加，抗凋亡蛋白BCL-2水平也部分下调。当CXCR2被敲低以后，H2O2诱导的U2OS细胞和NHF细胞的凋亡比例也明显增加。以上结果表明CXCR2具有促衰老抗凋亡的作用。
　　第四部分 NF-kB激活发挥抗凋亡促衰老作用
　　之前有很多研究表明白藜芦醇通过抑制NF-κB和NLRP3的活性发挥抗炎作用减少体内炎症反应。但是也有研究显示白藜芦醇可通过ERK，p38和Akt信号通路上调Ⅱ型胶原和COX-2表达，发挥促炎的作用。我们发现50μM白藜芦醇可以升高U2OS细胞内IL-6、IL-8、IL-1β和COX-2 mRNA水平，说明白藜芦醇可以导致U2OS细胞内炎症水平升高。我们还发现NAC可以缓解白藜芦醇导致的U2OS细胞内IL-8和IL-1β mRNA水平升高，说明氧化压力介导了白藜芦醇诱导炎症的产生。另外白藜芦醇可以诱导p-p65蛋白水平升高，NF-κB抑制剂可以部分缓解白藜芦醇导致的炎症因子水平的升高，说明白藜芦醇诱导炎症产生部分是通过NF-κB通路介导的。更重要的是NF-κB被抑制后凋亡比例数明显的增加，说明NF-κB在白藜芦醇诱导的细胞衰老过程中发挥抗凋亡的作用。另外白藜芦醇可以激活NF-κB，NF-κB抑制剂可以部分缓解白藜芦醇导致的炎症因子水平的升高。我们还研究了NF-κB的抗凋亡作用，发现白藜芦醇处理后BCL2等抗凋亡因子的表达上调被NF-κB抑制剂抑制，说明白藜芦醇通可能过激活NF-κB发挥抗凋亡和促衰老作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 白藜芦醇可以诱导细胞S期停滞、DNA损伤应答及细胞的衰老并且核苷可以缓解其诱导的衰老

材料与方法

结果

讨论

第二部分 复制压力和氧化压力在白藜芦醇诱导细胞衰老中的作用及相互关系

材料与方法

结果

讨论

第三部分 p53-CXCR2通路介导白藜芦醇诱导的细胞衰老

材料与方法

结果

讨论

第四部分 NF-κB激活发挥抗凋亡促衰老作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

在读期间发表学术论文

英文论文Ⅰ

英文论文Ⅱ