FOXO1子宫内膜样腺癌中的表达及对癌细胞生物学行为的影响和机制研究

摘要

本课题主要致力于探究FOXO1在子宫内膜癌发生和发展中的作用以及具体机制，研究内容分为以下三部分。
　　第一部分 FOXO1在子宫内膜样腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性
　　目的:
　　已有研究表明FOXO1在乳腺癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌等肿瘤中表达明显降低，而FOXO1在子宫内膜癌中表达及其与肿瘤临床病理特征的相关性尚不完全明确。本研究检测FOXO1 mRNA和蛋白在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况，同时探讨FOXO1蛋白表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征（患者年龄、肿瘤组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况）的相关性，初步证实FOXO1在子宫内膜样腺癌发生及发展过程中的作用。
　　方法:
　　本研究基于TCGA数据库分析了FOXO1 mRNA在子宫内膜癌和癌旁正常子宫内膜中的差异表达;采用实时荧光定量PCR分析FOXO1 mRNA在子宫内膜癌和癌旁正常子宫内膜中的表达情况;采用免疫组织化学技术检测FOXO1蛋白在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织中的表达情况;运用SPSS统计软件分析FOXO1的表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征（患者年龄、肿瘤组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况）的相关性。
　　结果:
　　1.TCGA公共数据库的基因表达谱芯片分析显示，与癌旁正常子宫内膜相比，子宫内膜癌组织中FOXO1 mRNA表达显著降低，P＜0.01。
　　2.RT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，子宫内膜样腺癌组织中FOXO1mRNA表达显著降低，P＜0.01。
　　3.免疫组化结果显示，FOXO1在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织中的阳性表达率分别90％、85.00％、45.07％。与正常子宫内膜和不典型增生子宫内膜组相比，子宫内膜样腺癌组织中FOXO1阳性表达率显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，正常子宫内膜组与不典型增生子宫内膜组差异不显著（P＞0.05）。
　　4.71例子宫内膜样腺癌患者FOXO1的阳性表达率与年龄、组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况的相关性分析显示，子宫内膜样腺癌中低分化组织中FOXO1的阳性表达率(38.18％)明显低于高分化组(68.75％)，差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ期FOXO1阳性表达率(16.67％)明显低于Ⅰ、Ⅱ期(50.85％)，差异有统计学意义（P＜0.05）;有淋巴结转移组FOXO1阳性表达率(11.11％)明显低于无淋巴结转移组(50.00％)，差异有统计学意义(P＜0.05)。＜60岁年龄组FOXO1阳性表达率与≥60岁年龄组FOXO1阳性表达率无显著差异（P＞0.05）。
　　结论:
　　1.FOXO1在子宫内膜样腺癌组织中低表达，FOXO1在子宫内膜样腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用。
　　2.FOXO1的表达与子宫内膜样腺癌组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况密切相关。
　　第二部分 FOXO1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响
　　目的:
　　已有研究表明FOXO1在多种肿瘤的发生、发展中起到非常关键的作用，而其在子宫内膜癌中的具体作用及机制尚未见报道。本研究通过检测FOXO1在子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、RL95-2、AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE中的表达情况，应用慢病毒载体过表达FOXO1，研究FOXO1过表达对子宫内膜癌细胞增殖、生长、迁移、侵袭和体内成瘤的影响以及FOXO1与SREBPI的相关性，进一步探讨FOXO1在子宫内膜样腺癌发生、发展过程中的作用。
　　方法:
　　应用蛋白质免疫印迹技术检测6种子宫内膜癌细胞系中FOXO1的表达情况，构建带GFP荧光FOXO1过表达及空质粒慢病毒载体，筛选出稳定转染的子宫内膜样腺癌细胞系。分别用MTT实验、平板克隆形成实验、transwell实验、体内成瘤实验检测FOXO1过表达对子宫内膜样腺癌细胞生物学行为的影响，并运用蛋白质免疫技术检测FOXO1过表达对SREBP1表达情况的影响。
　　结果:
　　1.蛋白质免疫印迹结果显示6株子宫内膜癌细胞:HEC-1-A、RL95-2、AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE中，FOXO1蛋白在AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE四株子宫内膜癌细胞系中的表达水平较低。选择低分化子宫内膜样腺癌细胞:AN3-CA，高分化子宫内膜样腺癌细胞:Ishikawa，进行后续慢病毒载体转染及实验。
　　2.病毒转染后倒置荧光显微镜观察FOXO1过表达慢病毒在子宫内膜样腺癌细胞AN3-CA、Ishikawa中的转导效率分别为91.42％、87.94％，转染有效。
　　3.MTT结果显示，过表达慢病毒载体组细胞增殖速度明显低于空白载体组（P＜0.05）。
　　4.平板克隆形成实验结果显示，过表达慢病毒载体组肉眼可见克隆形成数目显著少于空白载体组（P＜0.05）。
　　5.迁移和侵袭实验结果显示，过表达慢病毒载体组细胞迁移和细胞侵袭数目明显少于空白载体组(P＜0.05)。
　　6.蛋白质免疫印迹结果显示，过表达慢病毒组SREBP1蛋白的表达明显低于空白载体组（P＜0.05）。
　　7.裸鼠移植瘤实验结果显示，过表达慢病毒载体组移植瘤形成和生长速度明显低于空白载体组（P＜0.01）。注射28天后，过表达慢病毒载体组移植瘤重量显著小于空白载体组（P＜0.01）。
　　结论:
　　1.FOXO1在子宫内膜样腺癌中发挥抑癌基因作用，FOXO1过表达可抑制肿瘤细胞的增殖、生长、迁移和侵袭能力。
　　2.FOXO1过表达可抑制子宫内膜样腺癌细胞的体内成瘤能力。
　　第三部分 FOXO1对子宫内膜癌的作用机制研究
　　目的:
　　我们前期的研究表明FOXO1和SREBP1在子宫内膜癌的发生发展过程中均发挥重要作用，且已有研究显示FOXO1活化后能通过降低Sp1及SREBP-1c活性，而抑制SREBP转录，但二者在子宫内膜癌中的相关性及具体作用机制尚不明确。FOXO1是PI3K/Akt信号转导通路的下游基因，该通路是肿瘤发生过程中非常重要的信号转导通路，同时该通路活性可被多种癌基因及抑癌基调节，从而在肿瘤发生、发展中发挥作用。本研究拟分析FOXO1与SREBP1的互作情况，同时检测FOXO1过表达对PI3K/AKT信号转导通路的影响，初步探讨FOXO1在子宫内膜癌中发挥抗肿瘤作用的分子机制。
　　方法:
　　运用免疫共沉淀技术分析FOXO1与SREBP1的互作情况，并应用蛋白质免疫印迹技术检测FOXO1过表达对PI3K/AKT信号转导通路的影响。
　　结果:
　　1.免疫共沉淀结果表明，SREBP1是FOXO1的一种互作蛋白，FOXO1可能会通过与SREBP1互作在子宫内膜样腺癌中发挥抗肿瘤作用。
　　2.Western blot结果显示，与对照组相比，FOXO1过表达显著降低了AN3-CA和Ishikawa细胞系中PI3K和AKT的磷酸化水平（P＜0.05），FOXO1过表达抑制了PI3K/AKT信号转导通路。
　　结论:
　　1.FOXO1可与SREBP1发生相互作用来发挥抗肿瘤作用。
　　2.FOXO1可能通过PI3K/AKT信号转导通路发挥抑制子宫内膜样腺癌作用。
　　3.FOXO1可能是子宫内膜样腺癌治疗的一个新靶点，本研究为子宫内膜样腺癌的基因治疗提供了新的思路和线索。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 FOXO1在子宫内膜样腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第一部分相关图表

参考文献

第二部分 FOXO1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分相关图表

参考文献

第三部分 FOXO1对子宫内膜癌的作用机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分相关图表

参考文献

致谢

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