18F-FDG PET/CT代谢体积参数及microRNA-150为基础信号调节通路对非小细胞肺癌预后研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 基线18F-FDG PET/CT不同阈值的代谢体积参数作为Ⅲ期非小细胞肺癌预后因素的研究
　　目的:18氟脱氧葡萄糖正电子发射计算机体层扫描(18fluorodeoxy-glucose positron emission tomography，18F-FDG PET)对NSCLC有非常重要的预后价值，其中肿瘤代谢体积(metabolic tumor volume，MTV)和病灶总糖酵解值(total lesion glycolysis，TLG)在NSCLC的预后研究中仍存在争议。
　　细化并精确分析高代谢体积对Ⅲ期不能手术的NSCLC上的预后价值。而且，应用治疗前基线参数进行预后评估对于提高生存率是更加有益的，原因在于这样做可以使肿瘤患者根据不同的预后进行个体化分层治疗，使用最适合的治疗方案。
　　方法:本研究共收集78例NSCLC病例，均收治于山东省肿瘤医院放疗科，这些患者的住院时间范围在2009年1月1日至2012年12月31日。所有的病例在同步放化治疗前进行18F-FDG PET/CT显像全身检查，并需要完善如下相关检查:支气管镜检查或CT引导下经胸穿刺活检、头部CT或MR检查、胸部及腹部增强CT，以明确TNM分期。详细记录了每个病例的相关临床特征参数，如性别，年龄，肿瘤位置，T分期，N分期，AJCC分期，病理类型，ECOG评分，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变情况等以及PET/CT图像的代谢参数，包括原发灶的最大标准摄取值(SUVmax)，平均标准摄取值(SUVmean)，MTV，TLG。MTV是指大于或等于一个具体的SUV阈值的肿瘤代谢体积。COX比例风险模型(Cox's proportional hazards regression model)用于进行单因素分析和多因素分析，这些变量包括PET/CT相关参数，如SUVmax，TLG50％，TLG60％，MTV25，MTV40％，MTV50％，MTV60％，MTV70％，MTV80％，MTV90％，CTV及AUC-CSH等，和临床变量，如性别，年龄，肿瘤位置，AJCC分期，T分期，N分期，ECOG评分和病理类型。临床变量为二分类或三分类变量;PET/CT测得参数包括SUVmax，AUC-CSH,CTV,MTV25,MTV40％,MTV50％,MTV60％,MTV70％,MTV80％,MTV90％,TLG50％，TLG60％，通过各变量的中位数将患者分为两个亚组，即以上各变量均为二分类变量。每个临床变量亚组间的差异通过log-rank检验完成。治疗完成以后，所有的患者均开始每三个月一次的随访。
　　结果:COX比例风险模型单因素分析中，MTV50％，MTV60％，MTV70％，TLG50％，TLG60％，性别与ECOG与OS显著相关(HR=0.489，P(MTV50％)=0.013;HR=0.414,P(MTV60％)=0.002;HR=0.534,P(MTV70％)=0.024;HR=0.513,P(TLG50％)=0.013;HR=0.549,P(TLG60％)=0.029;HR=0.454,P(sex)=0.008;HR=0.500,P(ECOG)=0.011)，而MTV50％,MTV60％,MTV70％,TLG50％,TLG60％和ECOG与PFS显著相关(HR=0.477，P(MTV50％)=0.004;HR=0.500，P(MTV60％)=0.007;HR=0.554，P(MTV70％)=0.020;HR=0.502,P(TLG50％)=0.006;HR=0.596,P(TLG60％)=0.038;HR=0.496,P(ECOG)=0.005)。在COX比例风险模型多因素分析中，TLG50％与OS显著相关（HR=0.423，P=0.023），与PFS显著相关(HR=0.457，P(TLG50％)=0.029)。MTV60％与PFS显著相关(HR=0.402，P(MTV60％)=0.042)。SUVmax对于非手术Ⅲ期非小细胞肺癌OS与PFS都不是独立的预后因素（HR=0.885，P=0.717;HR=0.928，P=0.809）。为避免多重共线性，这些PET/CT代谢参数都是分别进入模型分析，并且使用年龄、性别、分期、病理类型、ECOG评分和肿瘤位置进行校正。
　　结论:
　　1.同步放化疗的Ⅲ期NSCLC中，基线PET代谢体积参数有一定的预后价值。
　　2.不同的SUV阈值来界定MTV而进行预后分析是很重要且必要的。
　　3.MTV60％与PFS统计学上有显著地相关性，MTV60％数值越大，PFS越短。
　　4.TLG50％与OS和PFS在统计学上呈负相关。TLG50％越大，OS与PFS均越短。
　　第二部分 抑制miR-150通过恢复APC表达抑制NSCLC的增殖和转移
　　目的:探究了miR-150在NSCLC生物学侵袭行为方面的作用，还有miR-150与NSCLC的病理分期和淋巴结转移的相关性，并且，miR-150在NSCLC中的靶基因APC是通过生物信息学方法预测的，并将在功能丧失或获得实验中进一步证实。
　　方法:在哈尔滨医科大学收集了87例NSCLC组织，使用正常肺细胞系（BEAS2B细胞）和6个肺癌细胞株(95C，95D, H460，H358，SPCA1，H1299)。首先在六孔板进行细胞培养，然后使用miR-150抑制物/阴性对照抑制物，miR-150 mimics/miR-NC，和/或APC siRNA/siRNA NC，在指定时间转染后获取细胞。定量PCR在ABI 7900 Fast Real-Time PCR system上操作，以U6为miR-150表达的内参，3-磷酸甘油醛脱氢酶作为APC的对照。靶蛋白表达使用第一抗体检测，β-肌动蛋白表达作为内参。H1299细胞使用miR-150 inhibitor或inhibitor NC转染，培养72小时。随后，细胞以胰蛋白酶消化。48小时后，以一抗和二抗检测盖玻片上的细胞，细胞核使用苯基吲哚(DAPI)染色。划痕实验将使用miR-150 inhibitor或inhibitorNC转染H1299细胞。使用200ul无菌枪头轻刮划痕于单层细胞表面。划痕的区域在开始时和结束时同时进行拍照，分析迁移的距离。细胞迁移侵袭实验使用侵袭小室，被覆基质胶的。将行结晶紫染色的H1299细胞，拍照和记录图像。MTT检测实验中，细胞孵育1h，测量各孔的吸光值在酶联免疫检测仪OD490nm处。克隆形成实验中，在12孔细胞培养板上，每个孔接种400个转染miR-150 inhibitor或inhibitor NC的H1299细胞，培养15天，结晶紫染色并计数。使用流式细胞仪评价miR-150 inhibitor对细胞周期的作用。
　　结果:miR-150表达量与NSCLC病理分期显著相关(x2=7.569;P=0.0227)。miR-150表达水平的变化与淋巴结是否转移统计学上明显相关。与正常肺细胞系BEAS-2B对比，miR-150在6个肺癌细胞系(95C, 95D, H460，H358，SPCA1，H1299)的表达水平显著增加。MTT数据表明，转染24，48，72小时后，转染了miR-150 inhibitor的H1299细胞的增殖水平明显下降(P＜0.05)。克隆形成实验显示，这些沉默miR-150表达的细胞集落形成能力表现出受损的情况(P＜0.001)。FACS试验研究结果显示miR-150表达抑制后，细胞在G1期显著积聚，向S期和G2/M期转化的细胞比例减少（P＜0.05）。转染miR-150 inhibitor的细胞与转染inhibitor NC的细胞比较，在划痕实验中划痕愈合延迟(P＜0.01)，并且通过transwell assays基质胶的侵袭能力下降（P＜0.01）。免疫染色显示，与inhibitor NC组比较，在miR-150 inhibitor组细胞E-钙粘蛋白（上皮细胞标记）免疫荧光强度显著增加，而波形蛋白（间质细胞标记）的免疫荧光减弱（P＜0.05）。此外，Western blotting实验结果显示miR-150表达沉默上调了APC的表达，并且降低了下游信号分子β-连环蛋白的积聚（P＜0.001），此二改变几乎被siRNA引起的APC表达抑制所逆转(P values＜0.001)。
　　结论:1.miR-150的表达水平在NSCLC肿瘤组织和NSCLC细胞系中都有上调。2.miR-150的水平与NSCLC的病理分期和淋巴结转移正相关。3.沉默miR-150在NSCLC细胞系中，可以使NSCLC细胞的生长能力降低，细胞周期进程受到阻滞，迁移和侵袭能力下降， EMT受到抑制。4.miR-150的靶基因APC是通过生物信息学方法预测，由荧光素酶报告基因实验和功能获得/丧失实验证实该预测。5.miR-150表达沉默对NSCLC细胞的增殖和侵袭的负性调控作用是被APC水平恢复和细胞内Wnt信号通路抑制所介导的。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 基线18F-FDG PET／CT不同阈值的代谢体积参数作为Ⅲ期非小细胞肺癌的预后因素的研究

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．2 18F-FDG PET／CT图像获取及分析

1．2．3 同步放化疗的实施过程

1．2．4 统计学分析

1．3 结果

1．3．1 原发肿瘤的PET／CT代谢参数的初步测定

1．3．2 PET／CT代谢体积参数与生存时间(OS与PFS)的相关性分析

1．3．3 MTV60％与TLG50％的分层预后分析

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

1．7 图表

第二部分 抑制miR-150通过恢复APC表达抑制NSCLC的增殖和转移

2．1 前言

2．2 材料方法

2．2．1 临床样本的收集

2．2．2 细胞培养

2．2．3 质粒载体转染

2．2．4 实时定量PCR

2．2．5 蛋白印迹法(Western blot)

2．2．6 免疫荧光染色

2．2．7 划痕实验

2．2．8 细胞侵袭迁移实验

2．2．10 克隆形成实验

2．2．11 流式细胞仪

2．2．12 生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验

2．2．13 统计方法

2．3 结果

2．3．2 沉默miR-150的表达抑制NSCLC细胞增殖和细胞周期进程

2．3．4 在NSCLC中miR-150作用于APC

2．3．5 沉默miR-150的表达通过恢复APC的表达抑制NSCLC细胞的生长和侵袭

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

2．7 图表

总结与展望

文献综述 18F-FDG PET／CT代谢体积参数及miRNA-150作为生物标志物用于预测非小细胞肺癌生存的现状及进展

致谢

攻读博士期间发表的论文

APPENDING PAPER Ⅰ

APPENDING PAPER Ⅱ