DCLK1在MET和ERK5表达调控中的作用研究及其对恶性胸膜间皮瘤预后的影响

摘要

本研究旨在探讨MET、ERK5和DCLK1是否可作为诊断恶性胸膜间皮瘤生物标记物的可能性，为MPM的免疫治疗提供新的靶向位点。
　　目的:
　　1.研究MET、ERK5和DCLK1在MPM细胞中的表达水平，阐明MET、ERK5和DCLK1作为诊断MPM生物标记物的可能。
　　2.研究DCLK1的表达与MPM患者生存期的关系，阐明DCLK1可能是评价MPM患者预后的一个因素。
　　3.通过细胞活性实验观察MET和ERK5抑制剂对MPM细胞增殖活性的影响。
　　4.通过Western blot技术和RT-PCR技术，观察MET抑制剂或ERK5抑制剂在转录水平以及翻译水平对MET/ERK5/DCLK1通路调控的影响。
　　5.研究MET抑制剂和ERK5的抑制剂与MPM的侵袭、转移的关系，为有效防治MPM提供药物治疗新靶点。
　　方法:
　　1.恶性间皮瘤组织及癌旁组织取自1997.7-2008.12加州大学旧金山医学中心结果确诊为MPM患者的标本。所取临床标本经加州大学旧金山医学中心伦理委员会审计批准。
　　2.免疫组化方法:对73例组织标本的组织微阵列切片及间皮细胞瘤细胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常间皮细胞系LP9行免疫组化染色，明确MPM组织标本及细胞中MET、ERK5和DCLK1的表达情况。
　　3.Celltiter-GloTM方法检测细胞增殖活性:细胞接种于96孔板培养，配制不同的XL184和XMD8-92药物终浓度后再细胞培养48h。加入CellTiter-GloTM试剂，检测板用GloMax-96微孔板多功能光度计进行读数，利用GraphPad Prism6软件，计算IC50值，并绘制剂量-反应曲线。
　　4.细胞迁移侵袭实验:经稀释的300μl Matrigel基质包被于6孔板小室中，收集药物处理后的细胞，无血清培养基制成细胞悬浮液，下室加入含10％血清的细胞培养基2.6ml，培养20h，取出小室，置于4g/L结晶紫的小孔内室温染色20min后显微镜下计数、照相。
　　5.肿瘤细胞成球实验:收集药物处理后的单细胞悬液，将1×103数量的细胞铺入24孔超低粘附培养板，加入无血清培养液，1周孵育后，10×倒置显微镜下计数肿瘤数目（直径超过60μm的肿瘤细胞）。
　　6.Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR):使用Rneasy Mini kit试剂盒提取处理后细胞的总RNA，经逆转录反应合成cDNA后，再进行实时定量PCR反应，检测目的基因mRNA表达水平的改变。
　　7.Western blot:使用细胞裂解液裂解处理后细胞，测定蛋白浓度，使其高温变性，再使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，最后应用免疫印迹检测目的蛋白的表达水平。
　　8.统计学分析:符合正态分布的数值变量资料以均数±标准差((x)±s)表示;两组之间的比较使用t test;多组之间的比较使用单因素ANOVA Scheffe法;比较MET、ERK5和DCLK1在同一恶性间皮瘤细胞中IHC染色强度使用Chi-square检验;其他的数据分析使用GraphPad Prism(Version6.0;GraphPad Software，San Diego，CA，USA);总生存曲线绘制采用GraphPad Prism中的Kaplan-Meier分析。所有统计学数据P＜0.05被认为具有统计学差异。
　　结果:
　　1.MET、ERK5和DCLK1在MPM组织标本及细胞中过度表达
　　(1)对73例组织标本的组织微阵列切片及间皮细胞瘤细胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常间皮细胞系LP9行MET、ERK5和DCLK1的免疫组化染色。分析数据表明，在间皮瘤组织中，MET、ERK5和DCLK1三种蛋白均中度阳性和强阳性表达的为38.4％(n=28)。MET、ERK5和DCLK1之间的相关性分析表明统计学有显著差异(P＜0.05)。
　　(2)在组织标本中对MET、ERK5和DCLK1行免疫组化评分，统计学分析表明，三者在间皮瘤组织标本的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织标本(P＜0.05)。
　　2.DCLK1高度表达提示MPM预后不良
　　(1)DCLK1在恶性间皮瘤组织中的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织，有明显的显著性差异(P=0.000409)，表明DCLK1可能对恶性间皮瘤的发生有致瘤作用。
　　(2)DCLK1在MPM肿瘤组织中的表达与患者临床病理资料的相关性分析:数据表明，DCLK1与患者的年龄、性别、吸烟状态和TNM分期之间均没有显著性差异(P＞0.05)
　　(3)DCLK1表达和MPM患者总生存期(OS)之间的相关性分析
　　DCLK1高表达者比低表达者总生存期明显缩短(P=0.0235)，表明DCLK1的表达水平可能是影响MPM患者生存期的一个因素。
　　3.MRT和ERK5的抑制剂能够抑制间皮瘤细胞的细胞增殖活性
　　采用Celltiter-GloTM方法检测细胞增殖活性，在剂量-反应曲线上可检测到各细胞株的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)和细胞活性。IC50表明XL184和XMD8-92对不同的细胞系，有不同程度的抑制作用，其药物浓度越高，MPM细胞的活性就越低。XL184和XMD8-92分别对MET、ERK5高表达的MPM细胞灵敏度较高。
　　4.MET或ERK5抑制剂可引起MET/ERK5/DCLK1通路DCLK1的下调
　　(1)采用Wesestern blot技术，间皮瘤细胞经XL184或XMD8-92处理后，检测发现磷酸化MET、磷酸化ERK5和DCLK1的蛋白水平下降。
　　(2)采用RT-PCR技术，间皮瘤细胞经XL184或XMD8-92处理后，检测发现DCLK1的mRNA水平明显降低，这些结果表明MET或ERK5的抑制剂能够降低MPM细胞磷酸化ERK5和DCLK1的表达。进一步说明了DCLK1位于MET/ERK5信号通路的下游。
　　5.MET或ERK5的抑制剂不仅能抑制H290细胞的迁移、侵袭，并且抑制H290细胞的肿瘤细胞成球能力
　　(1)采用Transwell细胞迁移、侵袭实验观察MET和ERK5的抑制剂处理H290细胞，20小时后发现处理组H290细胞穿透小孔的能力均较空白对照组DMSO明显下降表明MET或ERK5的抑制剂能抑制H290细胞的迁移和侵袭。
　　(2)采用肿瘤成球实验以观察MET和ERR5抑制剂对MPM肿瘤干细胞的自我更新能力的影响，表明H290细胞的球体形成的效率随药物的浓度的上升而下降，呈现出浓度依赖性。
　　结论:
　　1.本实验发现MET、ERK5和DCLK1在MPM肿瘤组织及细胞中高表达，且MET、ERK5和DCLK1在间皮瘤组织标本的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织标本。
　　2.在MPM患者中，DCLK1高表达者比低表达者生存期明显缩短，DCLK1有可能成为预测恶性胸膜间皮瘤预后的一个因子。
　　3.研究DCLK1在MET和ERK5表达调控中的作用，阐明了DCLK1位于MET和ERK5的下游水平。
　　4.探讨MET/ERK5/DCLK1信号传导通路的活性可能在MPM细胞的生长过程中发挥重要作用。MET、ERK5和DCLK1可能作为恶性胸膜间皮瘤诊断标记物，为MPM的免疫治疗提供新的靶向位点，并且阐明小分子抑制剂可能为恶性胸膜间皮瘤提供新的治疗手段。

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