代谢调节对动脉粥样硬化相关疾病的影响及其机制研究

摘要

本文从以下两部分进行了阐述：
　　论文Ⅰ 他汀相关骨骼肌损伤机制及干预的研究
　　本研究以高脂喂养的ApoE-/-小鼠为研究对象，建立他汀类药物相关骨骼肌损伤动物模型，探讨曲美他嗪是否通过调节骨骼肌能量代谢改善他汀类药物相关运动能力下降。
　　目的：
　　1.探讨运动训练中，曲美他嗪能否降低他汀类药物所致骨骼肌损伤，增强运动能力;
　　2.明确曲美他嗪是否通过改善线粒体功能与调节能量代谢降低骨骼肌损伤。
　　方法：
　　1.实验动物分组
　　4周龄ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养4周后称重，随机分为五组:对照组、运动组、运动+辛伐他汀组、运动+曲美他嗪组、运动+辛伐他汀+曲美他嗪组。运动组、运动+辛伐他汀组、运动+曲美他嗪组、运动+辛伐他汀+曲美他嗪组的小鼠进行8周的跑步训练，每周跑步训练5天。运动+辛伐他汀组小鼠在运动训练的基础上给予20mg/kg/d辛伐他汀灌胃。运动+曲美他嗪组小鼠在运动训练的基础上给予30mg/kg/d曲美他嗪灌胃。运动+辛伐他汀+曲美他嗪组小鼠在运动训练的基础上给予20mg/kg/d辛伐他汀与30mg/kg/d曲美他嗪灌胃。灌胃总时间为8周。
　　2.运动能力检测
　　试验末检测各组小鼠运动能力。
　　单杠实验:准备45cm×45cm铁丝网，铁丝粗2mm，网格18mm。铁丝网悬于软垫上方50cm。小鼠置于铁丝网中心，经头侧翻转铁丝网，计算小鼠力竭掉落时间。每只小鼠检测3次，计算平均值，每次试验间隔20min以上。
　　拉力检测:训练小鼠双上肢拉紧测力计，轻拉小鼠尾使小鼠腾空直至小鼠上肢离开测力计，记录测力计显示数值。检测3次，计算平均值。
　　运动耐力检测:采用平台式跑步机进行耐力检测。起始运动速度13m/min，每3min速度增加2m/min，起始跑道坡度为0°，每3min坡度增加2°直至14°。纪录小鼠力竭时运动时间与运动距离。
　　3.血液指标检测
　　小鼠心尖取血约1mL，肝素抗凝，2000 rpm4℃离心15min，分离血浆。拜耳1650血生化自动检测仪检测血浆葡萄糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯与游离脂肪酸水平。采用试剂盒检测血浆CK、乳酸水平。
　　4.病理学检测
　　对腓肠肌进行HE染色观察骨骼肌形态改变。Laminin免疫荧光观察中心核纤维水平。Slow MyHC与Fast MyHC免疫荧光检测肌纤维分型。对腓肠肌进行PAS染色观察骨骼肌糖原含量。Gomori染色检测碎裂红纤维(RRF)水平。
　　5.骨骼肌线粒体功能检测
　　提取骨骼肌线粒体，采用试剂盒检测线粒体复合体(Ш)、柠檬酸合酶活性，JC-1检测线粒体膜电位。
　　6.骨骼肌氧化应激水平检测
　　提取骨骼肌线粒体，Amplex Red检测线粒体内过氧化氢水平;腓肠肌组织制成匀浆，检测SOD与GSH/GSSG水平。
　　结果：
　　1.运动训练与辛伐他汀对ApoE-/-小鼠的血脂、CK水平的影响
　　与对照组相比，运动组ApoE-/-小鼠血脂、CK水平无显著变化;与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠血浆脂质水平显著降低;与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠血浆CK水平显著升高。表明辛伐他汀能够降低运动训练ApoE-/-小鼠的血脂水平，升高血浆CK水平，即辛伐他汀能够导致骨骼肌损伤。
　　2.运动训练与辛伐他汀对ApoE-/-小鼠运动能力的影响
　　与对照组相比，运动组ApoE-/-小鼠的运动能力显著增强。与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠运动能力降低。上述结果表明辛伐他汀能够抵消运动训练对ApoE-/-小鼠运动能力的增强作用。
　　3.运动训练与辛伐他汀对ApoE-/-小鼠骨骼肌纤维的影响
　　与对照组相比，运动组ApoE-/-小鼠骨骼肌纤维横截面积增加;与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠肌纤维横截面积降低。中心核纤维是骨骼肌纤维损伤后修复的表现，与对照组相比，运动组ApoE-/-小鼠骨骼肌中心核纤维无显著变化;与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠骨骼肌中心核纤维增加。表明辛伐他汀能够导致骨骼肌纤维萎缩与损伤。
　　结论:
　　1.曲美他嗪能够降低辛伐他汀所致ApoE-/-小鼠骨骼肌损伤，恢复运动训练对运动能力的改善作用;
　　2.曲美他嗪通过改善线粒体功能实现骨骼肌保护作用。
　　论文Ⅱ 脂肪细胞源exosomes携带Sonic Hedgehog调控巨噬细胞极化的机制研究
　　本研究将建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型，探讨ADEs携带的Shh对巨噬细胞表型转化的影响，及巨噬细胞极化在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用。
　　目的:
　　1.建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型，明确胰岛素抵抗脂肪细胞产生的ADEs对巨噬细胞M1型转化的作用;
　　2.探讨ADEs携带Shh介导的Ptch/PI3K/Gli信号通路在巨噬细胞极化中的作用;
　　3.探讨巨噬细胞M1型转化后分泌的exosomes对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响。
　　方法:
　　1.脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立
　　2.脂肪细胞腺病毒转染
　　3.提取ADEs
　　4.ADEs刺激巨噬细胞
　　分离培养小鼠骨髓巨噬细胞(BMDM)与RAW264.7巨噬细胞，饥饿24h后，50μg/mL ADEs刺激巨噬细胞24h;为明确Ptch与PI3K是否参与ADEs介导的巨噬细胞表型转化，分别在ADEs刺激前2h加入20μM Ptch抑制剂环巴胺，ADEs刺激前1h加入10μM PI3K抑制剂LY294002。
　　5.巨噬细胞极化检测
　　流式细胞术检测M1型巨噬细胞（CD11c+）与M2型巨噬细胞(CD206+)所占比例;检测巨噬细胞的粘附功能。
　　结果:
　　1.胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立
　　高糖高胰岛素刺激脂肪细胞24h后，脂肪细胞的IRS-1 Ser307位点磷酸化水平增高，IRS-1蛋白水平明显降低，Akt磷酸化水平降低;生理剂量胰岛素刺激下GLUT4细胞膜转位降低，葡萄糖摄取减少;脂肪细胞脂质含量增加。上述结果表明我们成功构建了脂肪细胞胰岛素抵抗模型。
　　2.胰岛素抵抗脂肪细胞来源ADEs携带Shh增加
　　3.ADEs携带的Shh对BMDM与RAW264.7巨噬细胞表型转化的影响
　　4.Ptch/PI3K/Gli通路在ADEs携带Shh介导的巨噬细胞M1型极化中的作用
　　(1)ADEs携带的Shh刺激巨噬细胞Ptch/Gli表达上调
　　与对照组相比，IRADEs刺激的RAW264.7巨噬细胞Ptch和Gli蛋白表达水平升高;中和抗体封闭ADEs携带的Shh或敲除IRADEs携带的Shh后，巨噬细胞Ptch和Gli蛋白水平降低;过表达ADEs携带Shh增加巨噬细胞Ptch和Gli蛋白表达水平。
　　(2)Ptch抑制剂阻断ADEs携带Shh介导的巨噬细胞M1型极化
　　Ptch抑制剂环巴胺显能够著降低巨噬细胞Ptch与Gli蛋白表达水平，减少ADEs携带Shh刺激的巨噬细胞M1型极化，降低巨噬细胞粘附功能。
　　(3)IRADEs刺激巨噬细胞PI3K磷酸化
　　与对照组相比，IRADEs刺激的RAW264.7巨噬细胞PI3K磷酸化水平升高;中和抗体封闭IRADEs携带的Shh或敲除IRADEs携带的Shh后，巨噬细胞PI3K磷酸化水平降低;过表达ADEs携带Shh增加巨噬细胞PI3K磷酸化水平。
　　(4)PI3K抑制剂阻断ADEs携带Shh介导的巨噬细胞M1型极化
　　ADEs刺激前1h加入PI3K的特异性抑制剂LY294002; LY294002显著降低巨噬细胞PI3K磷酸化水平，同时减少ADEs刺激的巨噬细胞M1型极化，降低巨噬细胞粘附功能。
　　5.巨噬细胞M1型极化对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响
　　(1)脂肪细胞与巨噬细胞共培养
　　与对照组相比，与ADEs携带Shh刺激巨噬细胞共培养的脂肪细胞IRS-1和HSL表达显著降低。
　　(2)巨噬细胞释放的exosomes对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响
　　收集ADEs携带Shh刺激巨噬细胞的培养上清，超速离心提取exosomes后刺激脂肪细胞，结果显示脂肪细胞IRS-1和HSL表达显著降低。
　　6.糖尿病患者血清Shh阳性exosomes检测
　　与对照组相比，2型糖尿病血清中Shh阳性exosomes含量显著增加。
　　结论:
　　1.胰岛素抵抗脂肪细胞释放的exosomes携带Shh增加，促进巨噬细胞M1型极化;
　　2.脂肪细胞源exosomes携带的Shh通过激活巨噬细胞内Ptch/PI3K/Gli信号通路介导巨噬细胞M1型极化;
　　3.脂肪细胞源exosomes携带的Shh刺激巨噬细胞M1型极化后进一步加重脂肪细胞胰岛素抵抗。

目录

声明

论文Ⅰ他汀相关骨骼肌损伤机制及干预的研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

论文Ⅱ 脂肪细胞源exosomes携带Sonic Hedgehog调控巨噬细胞极化的机制研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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