季铵化壳聚糖修饰的超氧化物歧化酶抗骨关节炎的药效学研究

摘要

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的退行性骨关节病变，主要累及负重大关节，病程缓慢，病人活动受限甚至丧失生活自理能力。目前普遍认为OA是由机械和生物因素共同作用下，软骨基质、软骨细胞和软骨下骨的合成与降解发生失衡而形成的，涉及关节力学、细胞因子、氧化应激和遗传因素等方面。大量研究表明，氧化应激通过参与胞内信号传导、软骨细胞衰老和凋亡、胞外基质的合成和降解以及滑膜炎症等过程，对OA病情的发展起到非常重要的作用。因此，提高机体的抗氧化能力被认为是治疗OA的可行方案。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是机体抗氧化酶系统的重要组成之一，能快速、高效地清除活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，使其成为治疗ROS相关疾病的潜在酶类药物。本课题组前期针对SOD存在的缺点，采用季铵化壳聚糖(6-O-2’-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，O-HTCC)成功地实现了对SOD的结构修饰，得到酶活保留率高、半衰期延长、入胞能力佳的结合物O-HTCC-SOD。基于此，本课题首先测定了O-HTCC-SOD体外对ROS诱导的软骨细胞损伤的保护作用;初步考察了大鼠关节腔单次注射结合物后的药动学特征;最后建立OA动物模型，系统评价了O-HTCC-SOD对OA的治疗效果。本学位论文取得的主要研究成果如下:
　　1.O-HTCC-SOD的制备与表征
　　通过简单的三步化学反应得到易溶于水的O-HTCC，产率为83.3％，红外光谱和核磁共振氢谱鉴定其结构，茚三酮比色法测得自由氨基率为81.52％。通过碳二亚胺介导的缩合法，可成功将O-HTCC和SOD共价相连，反应产率为54.7％，经一步弱阴离子交换柱层析分离纯化得到修饰酶O-HTCC-SOD，O-HTCC-SOD的酶比活力与修饰前SOD相当，电泳结果显示结合物的分子量为连续分布，电位分析显示结合物带有正电性。
　　2.O-HTCC-SOD对大鼠软骨细胞的保护作用评价
　　用胶原酶降解大鼠膝关节软骨提取大鼠原代软骨细胞，并利用阿利新蓝和甲苯胺蓝染色法鉴定，整个细胞实验部分只使用第二、三代细胞。用MTT法评价O-HTCC-SOD对软骨细胞的毒性，结果显示O-HTCC-SOD及SOD在酶活剂量不超过200U/mL时，对大鼠软骨细胞的体外生长无明显的影响。碘乙酸钠(monosodium iodoacetate，MIA)可以诱导大鼠软骨细胞损伤，低、中、高剂量的O-HTCC-SOD或SOD与软骨细胞共孵育24h和48h均可显著抑制MIA诱导的软骨细胞损伤(P＜0.01)，但孵育48h后O-HTCC-SOD对软骨细胞的保护效果明显高于SOD（P＜0.01），说明O-HTCC-SOD对软骨细胞的保护作用更持久。软骨细胞经O-HTCC-SOD(或SOD)、MIA依次单独处理后，O-HTCC-SOD三个酶活剂量组的细胞相对活力仍维持在90％左右，显著优于模型组细胞(P＜0.01);而SOD三个酶活剂量组的细胞相对活力均下降至60％左右，对MIA介导的软骨细胞坏死无明显的保护作用(P＞0.05)，因此，O-HTCC-SOD能够通过进入细胞内发挥抑制MIA介导的软骨细胞损伤的作用，而缺乏入胞能力的SOD则不能。软骨细胞经O-HTCC-SOD（或SOD）、MIA依次单独处理后，用DCFH-DA试剂盒测定胞内ROS水平，结果显示O-HTCC-SOD三个剂量组的胞内ROS水平显著低于模型组（P＜0.01），甚至下降至比对照组还要低的水平(P＜0.01)，而SOD三个剂量组的ROS水平与模型组的无明显差异(P＞0.05)，因此，O-HTCC-SOD可进入软骨细胞内发挥清除ROS的作用，而SOD则不能。
　　3.关节腔注射O-HTCC-SOD大鼠体内药动学初步研究
　　关节腔内单次注射O-HTCC-SOD和SOD，采用生物法检测SOD酶活，以研究药物在大鼠关节腔内的消除规律，结果显示:SOD和O-HTCC-SOD在0-168h内的药时曲线下面积(area under the curve，AUC0-168h)分别为18043.5(U·h)、91853.478(U·h)，其AUC0-∞分别为20061.932(U·h)、91910.091(U·h)，即O-HTCC-SOD的药时曲线下面积约为SOD的5倍，说明O-HTCC-SOD较SOD在关节腔内的生物利用度更高。SOD和O-HTCC-SOD的平均滞留时间(mean residence time，MRT)分别为14.915h和27.918h，O-HTCC-SOD的平均滞留时间约为SOD的2倍，说明O-HTCC-SOD在关节腔内滞留时间更长。
　　4.O-HTCC-SOD对大鼠骨关节炎的药效评价
　　通过关节腔内注射MIA建立大鼠OA模型，并于关节腔注射不同剂量的O-HTCC-SOD、SOD、O-HTCC及O-HTCC与SOD的混合物给予治疗，每周注射一次，治疗四周。结果显示:模型组的股骨及胫骨平台软骨色泽灰暗，出现软骨缺损，说明造模成功;O-HTCC-SOD低、中、高剂量组的股骨和胫骨平台软骨色泽与空白组无异，偶见小裂隙和小孔，SOD组与模型组情况相似，O-HTCC组和混合物组的关节软骨情况较模型组有一定程度上的改善，病理切片结果与膝关节的大体观察结果基本吻合，说明给予O-HTCC-SOD治疗可以有效地保护软骨细胞和维持软骨组织的正常形态。此外，大鼠膝关节腔注射MIA可以诱发后肢机械缩足阈值变化，O-HTCC-SOD三个剂量组自注射治疗后，机械缩足阈值逐渐提高至正常水平，而经SOD治疗后，机械缩足阈值无改善。用ELISA试剂盒测定大鼠外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，结果显示不同剂量的tO-HTCC-SOD均可在不同程度上明显降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平（P＜0.01），SOD、O-HTCC及混合物的效果不明显，说明经关节腔注射O-HTCC-SOD可以有效降低外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，减轻炎症反应;用化学发光法测定大鼠膝关节滑膜组织中MDA和GSH的含量，结果显示，O-HTCC-SOD可以显著降低滑膜组织中MDA的含量（P＜0.01），提高GSH的含量（P＜0.01），SOD、O-HTCC及混合物的效果不明显，说明经关节腔注射O-HTCC-SOD使关节局部的抗氧化水平得到提升。
　　总之，与未修饰的SOD相比，O-HTCC-SOD可以更有效地保护软骨细胞、维持关节软骨的正常形态、降低炎症因子水平和提高机体抗氧化水平，且其在关节腔内具有更高的生物利用度及更长的滞留时间，是一种具有研究和开发价值的治疗OA药物。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．骨关节炎概述

2．氧化应激与骨关节炎

2．1 氧化应激

2．2 骨关节炎的氧化应激机制

3．1 骨关节炎的临床治疗

3．2 骨关节炎的抗氧化治疗

4．骨关节炎动物模型

5．1 前期研究基础

5．2 本课题拟解决的问题

第二章 O-HTCC-SOD的制备和表征

1．实验材料

1．1 仪器

1．2 试剂

1．3 溶液

2．实验方法

2．2 O-HTCC的表征

2．4 O-HTCC-SOD的表征

3．实验结果与分析

3．1 O-HTCC的结构表征

3．2 O-HTCC-SOD的分离纯化

3．3 O-HTCC-SOD的表征分析

4．讨论

4．1 壳聚糖用作蛋白质药物修饰剂

4．2 壳聚糖修饰蛋白类药物的方法

4．3 壳聚糖修饰蛋白类药物的研究进展

5．本章小结

第三章 O-HTCC-SOD对软骨细胞损伤的保护作用

1．实验材料

1．1 仪器

1．2 实验试剂

1．3 实验动物

1．4 溶液

2．1 大鼠软骨细胞的分离、培养与鉴定

2．2 0-HTCC-SOD的软骨细胞毒实验

2．3 O-HTCC-SOD与MIA共同孵育对软骨细胞增殖的影响

2．5 O-HTCC-SOD对MIA诱导的软骨细胞胞内ROS水平的影响

2．6 数据处理

3．实验结果与分析

3．1 大鼠软骨细胞的形态与鉴定

3．2 O-HTCC-SOD对软骨细胞的毒性

3．3 O-HTCC-SOD与MIA共同孵育对软骨细胞增殖的影响

3．4 O-HTCC-SOD与MIA依次孵育对软骨细胞增殖的影响

3．5 O-HTCC-SOD对软骨细胞胞内ROS水平的影响

4 讨论

5 本章小结

第四章 关节腔注射O-HTCC-SOD大鼠体内药动学初步研究

1．实验材料

1．1 仪器

1．2 试剂与耗材

1．3 动物

1．4 溶液

2．实验方法

2．1 动物给药和分组方案

2．2 关节滑液样品采集

2．3 大鼠关节滑液中药物浓度检测

2．4 数据处理

3．1 关节腔单次注射给药后关节腔内SOD酶活残留量测定

3．2 SOD和O-HTCC-SOD的关节腔消除动力学

4．讨论

5．本章小结

第五章 O-HTCC-SOD对大鼠骨关节炎的治疗作用

1．实验材料

1．1 仪器

1．2 试剂与耗材

1．3 溶液

1．4 实验动物

2．实验方法

2．1 大鼠膝骨关节炎模型的制备、分组及给药方法

2．2 大鼠膝骨关节炎模型的观察指标与评分方法

2．3 大鼠膝骨关节炎痛感评价

2．4 生化指标检测

2．5 数据分析

3．实验结果

3．1 大鼠OA模型的建立

3．2 大鼠膝关节的大体及组织学评价

3．3 O-HTCC-SOD对MIA诱导大鼠膝关节痛感的缓解作用

3．4 大鼠外周血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量

3．5 大鼠膝关节滑膜组织匀浆中MDA和GSH的含量

4．讨论

5．本章小结

第六章 总结与展望

1．总结

2．展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间学术成果