Sca-1+心脏干细胞分化及凋亡的分子机制研究

摘要

在现今死亡率最高的疾病中急性心肌梗死等缺血性心脏病排名第一，其主要是由于冠状动脉受阻进而引发心脏局部缺血，心肌细胞数目急剧减少，进而引发心力衰竭。因此，治疗缺血性心脏疾病的关键是补充其数目。刺激内源心脏干细胞向心肌细胞分化可以有效补充心肌细胞数目，或成为有效的治疗手段，但其面临着两个急需克服的问题，局部低氧微环境引起的移植干细胞存活率低及分化率低。因此，寻找高效的分化诱导剂及相关存活机制将为治疗心肌梗死提供理论依据和分子靶标。
　　环糊精(CD)是由重复的6，7或8个葡萄糖单元（分别为α-，β-和γ-CD）构成的环状低聚糖。在CD中，β-环糊精(β-CD)可通过促进胆固醇代谢去除质膜中的胆固醇或增加细胞内游离的胆固醇水平，这种促进作用对动脉硬化和其他综合征有着治疗作用。之前的研究表明，β-CD能促进鸡心脏祖细胞向心肌细胞的分化，但其对于Sca-1+心脏干细胞向心肌细胞分化的作用尚未阐明。
　　NR4A2也叫Nurrl，与NR4A1，NR4A3共同组成了NR4A孤核受体家族。以往的研究表明:NR4A1在心肌细胞凋亡诱导中发挥重要作用，但NR4A2在凋亡中的作用还不清楚，是否参与心脏干细胞的凋亡还需进一步研究。
　　本论文发现β-CD能有效促进心脏干细胞向心肌细胞分化，并探讨了β-CD诱导分化的相关机制，同时对NR4A2在心脏干细胞凋亡中的作用及机制的阐释。
　　研究结果
　　1.β-CD通过自噬诱导Sca-1+CSCs向心肌细胞分化
　　1.1β-CD促进心肌细胞marker的表达
　　我们首先用不同浓度的β-CD处理CSCs，通过细胞形态观察和LDH活性检测，确定5mMβ-CD为无毒性的安全浓度。QPCR和免疫荧光检测β-CD处理CSCs14days后心脏转录因子GATA4和Nkx2.5，转录增强子Mef2c和心肌标志蛋白cTnt的水平，结果表明上述因子的RNA水平明显上调，并能够促进cTnt蛋白水平表达以及GATA4的入核。因此，β-CD处理CSCs14days能促进心肌细胞marker的表达。
　　1.2β-CD诱导CSCs分化为心肌细胞
　　流式细胞术、免疫荧光及Western blot结果表明β-CD处理CSCs14days，cTnt阳性细胞比例和蛋白水平明显上调，同时EDU增殖实验检测表明β-CD抑制CSCs增殖并对分化的心肌细胞无影响，表明β-CD可促进CSCs分化为心肌细胞。进一步的体内实验发现HP-β-CD对心肌梗死(MI)小鼠的心功能有明显改善，且使体内Sca-1和cTnt双阳性CSCs增多。因此，β-CD体内也能诱导CSCs向心肌细胞分化。
　　1.3β-CD在促进CSCs分化的过程中诱导自噬
　　在心肌细胞分化中自噬有至关作用，本论文检测了β-CD处理CSCs后LC3-Ⅱ的变化，Western blot结果表明LC3-Ⅱ蛋白水平上调，为了分析LC3-Ⅱ增多的原因，我们利用了3MA及BafA1。Western blot结果表明3MA处理后LC3-Ⅱ降低，Baf A1处理后LC3-Ⅱ的水平进一步升高，表明β-CD在促进CSCs分化的过程中诱导自噬。
　　1.4β-CD通过自噬诱导CSCs向心肌细胞分化
　　为了明确自噬是否参与到分化过程中，我们构建Atg5敲减的CSCs，用β-CD处理Atg5敲减CSCs14days，QPCR和免疫荧光检测表明阻断自噬后，分化被明显抑制，因此，β-CD通过自噬诱导CSCs向心肌细胞分化。
　　1.5自噬通过JNK/STAT3信号通路介导β-CD诱导的分化。
　　有报道发现在心肌细胞分化过程中JNK/STAT3信号通路参与其中。我们的Westernblot结果表明分化过程中JNK和STAT3的磷酸化均被上调。为了验证自噬与JNK/STAT3信号通路的关系，利用BafA1、3MA、Atg5敲减CSCs，发现抑制自噬后，JNK和STAT3的磷酸化被抑制。因此，β-CD介导的自噬通过JNK/STAT3信号通路诱导分化。
　　1.6自噬通过GSK3β/β-catenin信号通路介导β-CD诱导的分化。
　　GSK3β/β-catenin信号通路也参与到心肌分化的过程中，但是与自噬的关系尚未搞清。Western blot结果表明GSK3β/β-catenin信号通路在β-CD诱导分化过程中被激活，抑制自噬能破坏GSK3β/β-catenin信号通路的活化。因此，自噬通过GSK3β/β-catenin信号通路介导β-CD诱导的分化。
　　1.7脂筏与胆固醇参与β-CD诱导分化的过程
　　β-CD能够特异性清除膜胆固醇进而改变膜组分和结构，我们检测了β-CD与M-β-CD处理CSCs不同时间中脂筏marker Flot-1和Cav-1的变化，Western blot结果表明Flot-1无明显变化，但Cav-1降低，表明β-CD影响了脂筏。游离胆固醇检测试剂盒检测结果显示细胞内胆固醇在前期增多后期减少，同时Western blot检测β-CD处理CSCs7days和14days，胆固醇转运蛋白ABCA1蛋白水平升高。我们推测，ABCA1调节的胆固醇流出可能是引起自噬的关键原因，在β-CD诱导分化和过程中脂筏与胆固醇水平的变化存在至关作用。
　　2.ROS/NF-κB/NR4A2通路参与H2O2经自噬诱导CSCs凋亡的过程
　　2.1H2O2诱导CSCs凋亡
　　用浓度梯度的H2O2处理CSCs，通过细胞形态观察和LDH活性检测，确定500μM为无坏死的最大安全浓度。Western blot、Hoechst33258、流式细胞术、Caspase3活性检测结果确定500μM H2O2诱导CSCs凋亡。
　　2.2H2O2诱导CSCs自噬
　　自噬与凋亡密切相关，我们用不同浓度的双氧水处理细胞，检测自噬水平的变化，Western blot结果表明LC3-Ⅱ蛋白水平明显上调，3MA和BafA1与H2O2共同处理CSCs结合LC3-Ⅱ蛋白水平的变化，显示H2O2促进自噬的发生。
　　2.3H2O2通过促进自噬诱导凋亡
　　利用H2O2处理Atg5敲减的CSCs以及与3MA、Rapa共同处理CSCs。Western blot结果表明抑制自噬后凋亡降低，促进自噬后凋亡增强。因此，H2O2通过促进自噬诱导凋亡。
　　2.4H2O2通过NR4A2诱导CSCs自噬与凋亡
　　接下来我们寻找参与H2O2诱导凋亡与自噬的关键因子。QPCR，免疫荧光和Western blot实验结果表明H2O2诱导自噬与凋亡过程中NR4A2水平明显上调。接下来进一步确认NR4A2在H2O2诱导的自噬与凋亡中的作用，我们通过干扰RNA敲减NR4A2的水平。QPCR及Western blot结果表明NR4A2敲减后，逆转了H2O2诱导的自噬与凋亡，同时通过慢病毒的干扰与过表达NR4A2的回复实验进一步确定了NR4A2参与H2O2诱导的自噬与凋亡过程。
　　2.5NR4A2介导自噬调节凋亡
　　在自噬调节凋亡的过程，NR4A2是否发挥了作用呢？我们通过慢病毒LV3-siNR4A2构建NR4A2敲减的CSCs，同时加自噬促进剂雷帕霉素Rapa处理，Western blot结果表明敲减NR4A2后，逆转了Rapa的作用，表明NR4A2介导自噬调节凋亡。
　　2.6NF-κB是NR4A2上游直接调控因子
　　NF-κB参与H2O2诱导的多种凋亡途径，同时有相关文献报道，NR4A2的启动子区域有NF-κB的结合位点，那么在H2O2诱导的CSCs自噬与凋亡的过程中NF-κB是否与NR4A2有关系？我们的结果表明NF-κB被500μMH2O2激活，利用NF-κB的抑制剂Bay11-7082和H2O2共同处理CSCs，Bay11-7082能够逆转H2O2诱导的自噬与凋亡以及NR4A2的表达。进一步利用双荧光报告基因确定了NF-κB可直接结合到NR4A2的启动子区促进NR4A2表达。因此，在H2O2诱导的CSCs自噬与凋亡的过程中NF-κB是NR4A2的直接调控因子。
　　2.7ROS是NF-κB/NR4A2的上游因子
　　在H2O2处理环境下伴随ROS大量产生，那么在H2O2诱导的CSCs自噬与凋亡的过程中ROS是否参与其中？利用DCFH探针检测ROS水平，发现ROS被H2O2明显上调;利用ROS清除剂NAC处理，逆转H2O2诱导的自噬和凋亡。有关文献报道ROS能够激活NF-κB，那么我们推测ROS/NF-κB/NR4A2的信号通路存在于H2O2诱导的自噬与凋亡中，为了确定我们的假设，利用ROS清除剂NAC与H2O2共同处理CSCs，QPCR和Western blot表明NAC能够逆转H2O2诱导的p65的磷酸化和NR4A2的表达。因此，ROS是NF-κB/NR4A2的上游因子。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 β-CD通过自噬诱导Sca-1+CSCs向心肌细胞分化

前言

实验材料与方法

1．实验材料与主要仪器设备

2．主要溶液及试剂配方

3．实验方法

结果

讨论

附图

第二部分 ROS／NF-κB／NR4A2通路参与H2O2经自噬诱导CSCs凋亡的过程

前言

实验材料与方法

1．实验材料与主要仪器设备

2．实验方法

结果

讨论

附图

参考文献

致谢

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