肝素铁的制备及其靶向抑制铁调素抗炎性贫血的作用研究

摘要

铁是一种维持身体多种功能所需的元素，如DNA的合成和修复，氧气的输送和线粒体能量代谢等。铁代谢是通过铁调素(Hepcidin)来进行调节的。铁调素是一种多肽类激素，对铁代谢起负调控作用。铁调素能够与肝细胞表面的膜铁转运蛋白(ferroportin1，FPN1)结合，促进FPN1的内化和降解从而调节铁稳态。正常生理状况下，机体铁调素表达与血清铁水平呈负反馈关系。当血清铁过载时，肝脏合成分泌铁调素增多，加速了FPN1的降解，即关闭了铁向血液中转运的出口，从而减少了小肠上皮细胞和巨噬细胞向血液中输送铁;当血清铁不足时，肝脏表达铁调素量减少，FPN1通道开放增多，肝脏中储存的铁向血液中转运增加，同时小肠加大对铁的吸收，进而维持铁稳态。 慢性病性贫血(anemia of chronic disease，ACD)是铁调素失衡所导致的一类重要疾病，其发病原因主要是炎症刺激或慢性感染、肿瘤等因素导致的铁代谢紊乱。铁调素作为一种急性应激蛋白参与调控机体铁平衡。目前研究表明，铁调素的升高在ACD的发病过程中发挥重要作用。当机体受到如败血症、烧伤、炎性肠病等炎症或慢性感染刺激时，炎性细胞因子IL-6通过JAK-STAT信号通路刺激铁调素的表达，肝脏合成分泌的铁调素增多。患者体内血清铁调素显著升高，抑制了小肠上皮细胞摄取食物铁及巨噬细胞释放铁的过程，同时，铁被封闭于肝脏组织中难以被机体利用，最终导致低铁血症，诱发缺铁性贫血，表现为血清铁降低，组织中储存铁难以释放及炎性介质表达量增高等多种病理特征。但已有的治疗手段无法对慢性病贫血进行治疗，只能通过治疗炎症来达到治疗目的。 多种信号通路参与从铁调素基因表达、分泌、成熟为具有生物活性的铁调素过程，这些通路主要包括HJV（hemojuvelin铁调素调节蛋白）-BMP(bone morphogenetic protein骨形态发生蛋白)/SMAD(drosophila mothers against decapentaplegic)信号通路、弗林蛋白酶(Furin)-HJV信号通路等。此外，跨膜丝氨酸蛋白6(transmembrane protease serines6，TMPRSS6)、机体铁水平，炎症因子等均是影响对铁调素表达的因素。 研究表明，肝素具有较好的抑制铁调素活性，然而肝素强大的抗凝活性使其抗铁调素活性的应用受到出血风险的影响，因此研发具有低抗凝活性且高抗铁调素活性的肝素衍生物成为研究热点。研究发现，肝素葡糖醛酸邻二醇断裂的衍生物(glycol-split heparin，Gs-Hp)具有较低的抗凝活性和较好的抗铁调素活性，而进一步进行N-乙酰化的肝素衍生物抗铁调素的作用较弱。Gs-Hp可以快速有效的抑制肝脏中铁调素的表达，促进肝脏等储铁器官中的铁向血液中的转运，从而增加血液中的流通铁。在化学诱导产生炎症的小鼠体内，该肝素衍生物抑制SMAD-BMP6通路，减少体内铁调素的含量，其作用机制类似于铁调素结合蛋白HJV,靶向于BMP-HJV-SMAD通路，抑制IL-6和铁对铁调素的诱导作用。Gs-Hp较肝素相比降低了抗凝活性，同时保持了其高抗铁调素活性和抗炎、抗肿瘤作用，因此有望研发为一种治疗癌症和慢性病引起的贫血的新药。基于此，本课题拟研制一种肝素铁复合物，既能够降低肝素的抗凝活性，又能够保持肝素的抗铁调素活性，同时还能补充贫血患者体内缺乏的流通铁，从而达到治疗慢性病贫血的目的。本课题以肝素钠为对照，通过①考察肝素铁对HepG2细胞铁调素表达的影响;②考察肝素铁对小鼠慢性炎症性贫血模型以及急性炎症贫血模型的作用，探讨其抗铁调素活性以及抗炎症贫血的作用。 本研究取得的主要成果有以下几方面: 1.肝素铁的制备与稳定性考察 通过超声的方法将肝素钠溶液与DHOF溶液混合制得4种肝素铁复合物，并通过粒径与电位，以及透射电镜的测定，确定其结构为球状纳米颗粒。4种肝素铁复合物粒径均小于100nm，且电位相对较大，结构较稳定。此种方法所需原料易得，实验步骤较为简单易行。经过8周的稳定性实验考察，所制得的肝素铁纳米复合物在室温条件下均保持澄清透明，无肉眼可见聚沉。经过粒径与电位测定的考察，发现肝素铁纳米复合物粒径随着时间的变化均有所增加，但仍然保持在200nm以内，具有较好的生物活性，说明本研究所制得的肝素铁纳米复合物具有较好的稳定性。 2.肝素铁体内外抗凝活性的检测 通过肝素铁体内外抗凝效价的检测，发现所获得的肝素铁能够大幅度减少肝素的抗凝活性，通过羊血浆抗凝实验与抗FXa、抗FIIa活性检测，发现肝素铁的抗凝效价降低至肝素的一半，肝素铁2抗FXa活性为95U/mg，肝素铁2抗FIIa活性为85U/mg;小鼠体内实验表明，肝素铁与肝素钠相比，能显著缩短小鼠尾部出血时间（P＜0.001）。这些结果表明本课题所制得的肝素铁具有较好的掩蔽肝素抗凝效果的作用，可以应用于小鼠体内实验，从而减少肝素的出血风险。 3.MTT法测定肝素铁纳米复合物对肿瘤细胞HepG2增殖的影响 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测了肝素钠及4个肝素铁复合物对HepG2细胞增殖的影响。研究发现，0-50μg/mL的肝素及肝素铁复合物作用48h后，均对肿瘤细胞的增殖均未表现出明显的抑制作用（P＞0.05）。其中，在高浓度(50μg/mL)时，肝素铁4具有明显的细胞增殖促进作用(P＜0.05)，说明所合成的肝素铁纳米颗粒均无明显的细胞毒性。 4.qRT-PCR法测定肝素铁对HepG2细胞铁调素mRNA的影响 通过qRT-PCR的方法在HepG2细胞中考察4个肝素铁的抗铁调素活性，结果表明在没有IL-6刺激时，给药浓度低于0.5μg/mL时，4个肝素铁即表现出较好的降低铁调素mRNA表达的作用。在体外模拟炎症反应实验中，在有IL-6的刺激下，给予0.4μg/mL肝素铁2后，HepG2细胞中铁调素mRNA表达量达到最低。其作用结果与肝素钠类似，说明本课题合成的肝素铁能够保持肝素钠的抗铁调素活性。 5.ELISA法测定肝素铁对HepG2细胞铁调素表达的影响 采用ELISA法测定肝素铁对铁调素表达的影响，将HepG2细胞与IL-6一起孵育，肝素铁及肝素钠分别与50ng/mL IL-6一起作用于HepG2细胞16小时，测定细胞培养液上清中铁调素的表达量。结果表明，在给予1.6μg/mL时，肝素铁呈现出抑制铁调素蛋白表达的作用，当肝素铁浓度达到6.4μg/mL，铁调素蛋白水平与正常组铁调素水平相当，说明本课题研制的肝素铁复合物具有降低炎症反应中铁调素表达的作用。 6.肝素铁对慢性炎症贫血小鼠血红蛋白含量的影响 采用松节油注射小鼠双肩胛骨脂肪垫法复制小鼠炎症贫血模型。结果表明，炎症贫血模型组小鼠血红蛋白水平降低至9.8pg/L，与正常组血红蛋白水平(13pg/L-15pg/L)相比，差异显著（P＜0.01）;炎症贫血小鼠给予肝素钠和肝素铁干预，每天尾静脉注射6mg/Kg的肝素铁、肝素钠，持续给药4周。与炎症贫血模型组小鼠相比，肝素钠组和肝素铁组小鼠的血红蛋白水平均显著提高(P＜0.01)，由8.2pg/L分别提高至11.7pg/L、11.6pg/L，这表明肝素铁具有和肝素钠类似的活性，能够改善炎症所致贫血。 7.肝素铁对慢性炎症贫血小鼠血清中铁调素含量的影响 采用松节油注射小鼠双肩胛骨脂肪垫法复制小鼠炎症贫血模型。结果表明，炎症贫血模型组小鼠铁调素水平升高至23ng/mL，与正常组(5ng/mL)相比，差异显著(P＜0.001)。对炎症贫血小鼠给予肝素钠和肝素铁干预，每天尾静脉注射6mg/Kg的肝素铁和肝素钠，持续给药4周。肝素钠组与肝素铁低剂量给药组小鼠铁调素水平分别降低至8ng/mL和9ng/mL，与正常对照组小鼠的铁调素水平5ng/mL相比无显著差异(P＞0.05)。这表明，肝素钠和肝素铁均具有显著的降低炎症贫血中铁调素含量的作用。实验还发现，对于炎症贫血小鼠升高的铁调素水平，给予EPO、双氯芬酸钠干预，均不具有降低炎症贫血模型中铁调素表达的作用。 8.肝素铁对急性炎症模型小鼠中铁调素表达作用通路的影响 采用腹腔注射LPS法复制小鼠急性炎症贫血模型。结果表明，急性炎症贫血模型组小鼠与正常组相比，Id1mRNA、Socs3mRNA、Crp mRNA、Hamp mRNA的含量均显著升高（P＜0.01)。对急性炎症贫血小鼠给予肝素钠和肝素铁干预，腹腔注射0.06mg/mL肝素铁、肝素钠溶液0.2mL，肝素铁和肝素钠组小鼠Id1mRNA、Socs3mRNA、Crp mRNA、Hamp mRNA的含量较模型组小鼠均显著降低(P＜0.01)，与正常对照组小鼠的Id1mRNA、Socs3mRNA、Crp mRNA、Hamp mRNA水平相比无显著差异（P＞0.05）。此结果表明肝素铁与肝素钠抑制Id1mRNA的BMP/SMAD途径，Socs3mRNA的STAT3途径，Crp mRNA影响的NF-kB通路。肝素铁与肝素钠通过抑制这三种通路来缓解炎症症状，减少炎症反应中铁调素的表达量。 总之，在本课题研制了一种安全的铁调素抑制剂——肝素铁，通过抑制BMP/SMAD以及JAK/STAT3通路抑制铁调素的表达，从而发挥纠正小鼠慢性炎症贫血的作用，显示出成为靶向抑制铁调素治疗炎症贫血的新药潜力。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章前言

1．铁调素的发现

2．铁调素的结构

3．铁调素对铁代谢的调控作用

3．1铁稳态与铁代谢

3．2铁调素对铁稳态的调节

4．铁调素的调节机制

4．1红细胞生成调节铁调素

4．2炎症和氧化应激调节铁调素

4．3铁浓度和贫血对铁调素的调节

5．铁调素的基因调控

6调控铁调素表达的基因缺陷导致的相关疾病

7．铁调素为靶点的药物作用类型

7．1铁调素激活剂

7．2铁调素拮抗剂

7．3肝素及其衍生物作为铁调素拮抗剂对铁调素代谢的影响

8．本课题研究思路与设计

第二章肝素铁的制备及性质研究

1实验材料

1．1实验试剂

1．2实验仪器

2．实验方法

2．1肝素铁的制备方法

2．2肝素铁的粒径与Zeta电位的测定

2．3肝素铁的透射电镜观察

2．4肝素铁的体内外抗凝活性检测

2．5肝素铁样品中游离铁含量测定

2．6肝素铁的初步稳定性考察

3结果

3．1肝素铁的粒径与Zeta电位的测定

3．2肝素铁的透射电镜观察

3．3肝素铁的体内外抗凝活性检测

3．4肝素铁样品中游离铁含量测定

3．5肝素铁的初步稳定性考察

4讨论

第三章肝素铁体外抑制铁调素表达作用研究

1实验材料

1．1细胞株

1．2试药

1．3实验仪器

2实验方法

2．1细胞复苏

2．2细胞传代

2．3 MTT法测定肝素铁对HepG2细胞增殖的影响

2．4 RT-PCR法测定肝素铁对铁调素mRNA的影响

2．5 ELISA法测定肝素铁对铁调素表达量的影响

3．结果

3．1 MTT法测定肝素铁对HepG2细胞增殖的影响

3．2 RT-PCR法测定肝素铁对铁调素mRNA转录的影响

3．3 ELISA法测定肝素铁对铁调素表达量的影响

4讨论

第四章肝素铁对炎症性贫血小鼠的治疗作用研究

1材料

1．1动物

1．2实验试剂

1．3实验仪器

2方法

2．1样品的配制

2．2建立小鼠ACD模型

2．3检测指标

3结果

3．1动物生长状态及小鼠体重

3．2小鼠血常规指标检测

3．3小鼠血清中铁调素含量的检测

3．4肝素铁对小鼠体内抗凝活性的影响

4讨论

第五章肝素铁对急性炎症小鼠铁调素转录与表达的影响研究

1材料

1．1动物

1．2实验试剂

1．3实验仪器

2．1样品的配制

2．2建立小鼠AI模型

2．3检测指标与方法

3结果

3．1血浆中的铁调素含量检测

3．2血浆、肝脏、脾脏中的铁含量检测

3．3肝脏总RNA的提取和Id1、Socs3、crp、Hamp mRNA含量检测

4讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及申请的专利