mTOR在糖尿病肾病大鼠足细胞病变中的作用及雷帕霉素的保护作用

摘要

本研究通过观察糖尿病肾病动物肾脏组织中足细胞自噬水平的变化及mTOR蛋白表达的变化，明确mTOR蛋白对自噬调控的途径。 目的: 1.观察DN大鼠肾脏组织中足细胞自噬及凋亡的变化，检测自噬蛋白mTOR、S6K1、LC3Ⅱ及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9，证实糖尿病肾病肾脏足细胞同时存在自噬和凋亡两种不同细胞死亡的病理过程。 2.明确mTOR蛋白对足细胞自噬和凋亡的调控机制。 3.RAPA可以与mTOR蛋白受体结合，对mTOR蛋白活化进行抑制，本研究力图证实RAPA是否通过抑制mTOR蛋白活化改善肾脏足细胞自噬和凋亡的变化，发挥对足细胞的保护作用。 方法: 1.动物实验研究 1.1各组糖尿病肾病大鼠临床指标的观察: 选取雄性SD大鼠，体重150-200g，通过STZ腹腔注射，制备糖尿病肾病大鼠模型，随机分为三组，正常对照组(NC组)、糖尿病肾病组(DN组)、雷帕霉素组(RAPA组)。检测0、4、8、12周血肌酐、24h尿量及尿蛋白定量，观察大鼠临床指标变化，作为临床评价指标。 1.2足细胞标志性蛋白podocin、nephrin在大鼠肾脏皮质中的表达:实验末麻醉后处死大鼠留取肾脏标本，免疫组化及免疫荧光定量PCR检测podocin、nephrin蛋白表达。 1.3糖尿病肾病大鼠肾脏皮质中mTOR蛋白的表达检测:采用免疫荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测mTORC1蛋白在各组大鼠肾脏组织中的表达。 1.4mTOR蛋白活化后对其下游蛋白表达的影响:分别采用免疫荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测肾脏皮质中S6K1蛋白及LC3Ⅱ蛋白的表达，结合电镜及免疫组化学检测足细胞损伤变化。 1.5足细胞凋亡在糖尿病肾病大鼠肾脏组织中的表达:western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-caspase3和c-caspase9的表达。 2.细胞实验研究: 2.1预实验:将足细胞置于不同浓度的葡萄糖培养基中，观察足细胞的生长状况，MTT法筛选出适合细胞实验的浓度作为后续实验的葡萄糖浓度标准。将不同浓度的RAPA加入培养基中，观察足细胞生长状况，MTT法筛选出适合实验要求的RAPA干预浓度。 2.2高糖对体外肾脏足细胞凋亡的影响:体外培养肾脏足细胞，将足细胞分为两组:正常对照组(NC组）和高糖组(HG组)。NC组足细胞置于5mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液中，HG组置于含350mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液中，24小时后TUNEL法检测足细胞的凋亡变化。 结果: 1糖尿病肾病状态下糖尿病肾病大鼠肾脏病变及足细胞的损伤: 1.1各组大鼠生化指标检测:动物饲养实验前、实验中及实验末（0、4、8、12周），检测三组大鼠尿量、尿蛋白及血肌酐水平。结果显示，DN组大鼠尿量较其余两组增多，尿蛋白定量增加，血肌酐水平增加，肾功能受损明显;RAPA组大鼠以上指标较NC组增加，但较DN组改善。 1.2各组大鼠病理学改变:电镜下观察三组大鼠肾脏足细胞病理学改变，DN组大鼠足细胞较NC组结构改变，足突消融，数量减少，系膜区基质增生，系膜细胞增殖，肾小球毛细血管滤过网出现局灶阶段性硬化;RAPA组大鼠足细胞及肾小球滤过膜较NC组病变明显，足细胞出现足突消融，结构改变，系膜区及肾小球滤过膜病变明显，但与DN组相比有明显改善。 1.3各组大鼠足细胞标志蛋白的变化:结果显示，podocin、nephrin蛋白在DN组大鼠肾组织中表达显著减少，扩增倍数下降;RAPA组podocin、nephrin蛋白较NC组表达减少，较DN组改善。 1.4自噬在各组大鼠肾脏皮质中的表达及RAPA的保护作用:通过western blot及免疫荧光定量PCR检测mTOR、S6K1及LC3Ⅱ蛋白表达，结果提示，DN组大鼠肾脏组织中mTOR蛋白较NC组明显增加，RAPA组较DN组改善，而自噬体LC3Ⅱ表达与之相反，DN组大鼠肾脏组织中LC3Ⅱ较NC组减少，RAPA组改善;DN组大鼠肾脏组织中S6k1蛋白较NC组明显增加，RAPA组较DN组改善。 1.5凋亡在各组大鼠肾脏皮质中的表达及RAPA的保护作用:通过western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9。结果提示，DN组大鼠肾脏组织中Bax/Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9较NC组明显增加，RAPA组较DN组改善，凋亡因子在糖尿病肾病大鼠模型中表达明显，RAPA干预后凋亡因子表达出现下降，对肾脏足细胞有一定的保护作用。 2体外细胞实验研究高糖状态下肾脏足细胞凋亡的变化、自噬蛋白在细胞中的表达: 2.1预实验结果:MTT法筛选培养基高糖浓度。葡萄糖浓度设置:0、5、10、15、20、25、30、35、40mmol/L，结果表明，当糖浓度高于35mmol/L时，对细胞的抑制率达到100％，不适合细胞实验。在0-35mmol/L范围内继续筛选，葡萄糖浓度为35mmol/L时，细胞抑制率大约在20％左右，而在5mmol/L或者10mmol/L时，抑制率很低。MTT发筛选不同浓度RAPA对足细胞的影响。结果显示，葡萄糖浓度为35mmol/L条件下，当雷帕霉素为5到15ng/ml时细胞活率有明显的上升趋势，时间点为24h为宜。 2.2高糖状态下足细胞表型功能的变化:流式细胞仪检测足细胞表型功能变化。葡萄糖浓度35mmol/L状态下，肾足细胞铺板密度60％-80％，24h后直接加入35mmol/L的高糖的培养基，并向培养基中加入RAPA(浓度ng/ml:0，5，10，15)处理细胞24h，后送流式凋亡，设置分组:blank(正常完全培养基)，0(35mmol/L糖的完全培养基)，5(35mmol/L糖的完全培养基+5ng/ml的RAPA)，10(35mmol/，糖的完全培养基+10ng/ml的RAPA)，15(35mmol/L糖的完全培养基+15ng/ml的RAPA)。实验显示，RAPA浓度为5-15ng/ml时的确对细胞凋亡有缓解作用，凋亡细胞比例明显降低。后续实验选择15ng/mlRAPA处理细胞，对相关蛋白进行检测。 2.3TUNEL检测高糖状态下足细胞凋亡的变化:根据流式细胞学检测结果，设置分组:HG组(35mmol/L糖的完全培养基)，HG+RAPA组(35mmol/L糖的完全培养基+15ng/ml的RAPA)。结果显示，HG组足细胞在200倍及400倍荧光显微镜下均可见凋亡小体，HG+RAPA组在同样倍数显微镜下凋亡小体数量减少，提示RAPA对高糖状态下足细胞凋亡有改善作用。 2.4自噬蛋白在高糖状态下足细胞中的表达:western blot检测mTORC1、S6K1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1等自噬蛋白，设置分组:HG组(35mmol/L糖的完全培养基)、HG+RAPA组(35mmol/L糖的完全培养基+15ng/ml的RAPA)。结果显示，HG组足细胞中mTORC1、Beclin-1表达增加，S6K1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平减少，足细胞中自噬蛋白表达出现明显变化，细胞自噬减弱。HG+RAPA组足细胞中mTORC1、Beclin-1表达较HG组减少，S6K1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达较HG组增加，RAPA对足细胞自噬有改善作用。 结论与创新性: 1.本研究明确了糖尿病肾病发病过程中，高糖可以诱导mTORC1蛋白表达增加，而mTORC1蛋白亦可以作为独立危险因素诱导自噬体标志性蛋白LC3Ⅱ表达减少，提示两者之间存在联系。同时，在动物模型中我们也检测到Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9等凋亡因子的表达增加，提示自噬、凋亡两者细胞变化存在一定联系。 2.RAPA作为mTORC1蛋白特异性抑制剂，可以与mTORC1蛋白紧密结合，对mTORC1蛋白表达进行调控，从而达到保护病变足细胞的作用。 3.mTOR蛋白与LC3Ⅱ之间需要信号转导，S6K1作为mTOR蛋白的下游信号传导蛋白之一，可以对LC3Ⅱ蛋白的表达进行调控，从而证明mTOR-S6K1-LC3Ⅱ信号通路的存在。 4.mTORC1蛋白表达与Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9等凋亡因子的表达增加呈正相关，而且有研究提出mTORC1蛋白可以调控凋亡蛋白的表达，提示mTORC1蛋白在足细胞变化中发挥着重要作用。

目录

声明

摘要

符号缩略

前言

实验材料

第一部分mTOR蛋白对糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞自噬的调控及雷帕霉素的保护作用

实验内容

实验结果

讨论

结论

附录

第二部分mTOR信号通路在糖尿病状态下足细胞凋亡中的表达

实验方法

实验结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

致谢

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