Nrf2/ARE信号通路在急性百草枯中毒大鼠肺损伤中的作用及莱菔硫烷的干预机制研究

摘要

百草枯（Paraquat,PQ）作为一种在全世界广泛使用的除草剂,能够引起机体以急性肺损伤为主要病理改变的全身多器官功能障碍,伴有极高的致死率。转录因子核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid2-related factor2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)信号通路对于细胞抵抗外界应激反应是必不可少的内源性抗氧化保护机制。莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一种常见的具有保健功能的异硫氰酸酯,同时其具有良好的抗氧化功效。 目的:本研究旨在探究Nrf2/ARE信号通路在PQ诱导的大鼠急性肺损伤中的调控作用以及研究莱菔硫烷治疗PQ诱导的肺损伤保护机制。 方法:本研究首先拟采用正常健康大鼠,通过一次性腹腔注射毒物的方法建立急性百草枯中毒模型,首先研究Nrf2/ARE信号通路在大鼠急性百草枯中毒后动态表达、分布情况,其次利用百草枯中毒模型探究Nrf2/ARE信号通路在大鼠急性百草枯中毒后的肺保护作用及其调控机制,最后进一步验证以该通路为靶点的药物SFN对急性百草枯中毒的肺保护作用机制,以期为临床治疗百草枯中毒提供新的思路。因此,本研究分为三个部分,第一部分为Nrf2/ARE通路在大鼠急性百草枯中毒后肺组织动态表达研究,第二部分为Nrf2/ARE通路在百草枯中毒肺损伤中的作用,第三部分为莱菔硫烷治疗急性百草枯中毒大鼠肺损伤的分子机制研究。 第一部分中大鼠被随机分为对照组(n=30)和PQ组(n=30),PQ组给予大鼠一次性腹腔注射PQ(40 mg/kg),对照组腹腔注射等量的生理盐水。在注射PQ12h、24h、48h、72h和120h后,每个时间点6只大鼠,分别在相应时间点处死后分离大鼠的肺组织用于后续实验。具体方法如下: (1)取出部分肺组织,多聚甲醛固定,用于石蜡包埋和切片,后续进行病理学检测,采用HE染色观察染毒后不同时间点肺组织病理改变; (2)取出部分肺组织用于检测湿干比值（wet/dry,W/D）变化,检测染毒后不同时间点肺组织水肿情况; (3)处死大鼠前尾静脉取血3ml,离心后取血清行血清MDA、SOD含量检测,判断大鼠染毒后不同时间点体内氧化还原平衡的改变; (4)取出左肺行支气管肺泡灌洗术,采集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid,BALF)用于检测TNF-α和IL-1β,检测染毒后不同时间点肺组织炎症反应水平; (5)病理切片,行免疫组化检测染毒后不同时间点肺组织中Nrf2和下游因子血红素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1)的表达; (6)取部分肺组织,提取RNA,进行逆转录,合成cDNA,扩增后监测大鼠染毒后不同时间点肺组织Nrf2和HO-1的mRNA表达水平; (7)取出肺组织,用Westem-blot检测染毒后不同时间点肺组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达; 第二部分中大鼠被随机分为四组:对照组(n=6)、PQ组(n=6)、Nrf激动剂+PQ组(n=6)和Nrf抑制剂+PQ组(n=6)。PQ组大鼠给予腹腔注射单剂量的PQ(40 mg/kg),Nrf激动剂+PQ组大鼠在PQ注射前72h尾静脉注射Nrf激动剂(30mg/kg/day),Nrf抑制剂+PQ组大鼠在PQ注射前72h尾静脉注射Nrf抑制剂(80mg/kg/day),对照组腹腔注射等量的生理盐水,PQ注射48h后分离大鼠的肺组织用于后续实验。具体操作方法同第一部分。 第三部分中大鼠被随机分为四组:对照组(n=6)、PQ组(n=6)、PQ+SFN组(n=6)和PQ+生理盐水组(n=6)。PQ组大鼠给予腹腔注射单剂量的PQ(40mg/kg),对照组腹腔注射等量的生理盐水,PQ+SFN组和PQ+生理盐水组在腹腔注射PQ30min后分别腹腔注射给予单剂量的SFN（5 mg/kg）和等体积的生理盐水。大鼠在PQ注射48h之后被处死,分离肺组织用于后续实验。具体操作方法同第一部分。 结果:第一部分: 1.对照组大鼠的肺泡完整,没有任何免疫细胞的浸润。相反,PQ组大鼠的肺泡膜结构被破坏,肺上皮细胞肿胀,基底膜增厚,肺泡内充满大量的免疫细胞和红细胞; 2.PQ组24h后大鼠肺W/D比值显著高于对照组（P＜0.05）,且大鼠PQ处理时间越长,肺W/D比值越高; 3.PQ组大鼠血清中MDA的含量显著高于对照组（P＜0.05）,且PQ处理时间越长,MDA的含量越高;PQ组大鼠血清中SOD的活性显著低于对照组(P＜0.05),且PQ处理时间越长,SOD的活性越低; 4.ELISA显示与对照组相比,PQ组大鼠肺组织中TNF-α和IL-1β的表达水平显著高于对照组(P＜0.05),且PQ处理时间越长,TNF-α和IL-1β的表达水平逐渐增高; 5.RT-PCR显示PQ组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的mRNA表达水平明显增高(P＜0.05),且PQ处理时间越长,Nrf2和HO-1的mRNA表达水平越高; 6.免疫组化显示与对照组相比,PQ组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平明显增高(P＜0.05),且PQ处理时间越长,Nrf2和HO-1的蛋白表达水平越高; 7.Western-blot结果显示与对照组相比,PQ组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平明显增高(P＜0.05),且PQ处理时间越长,Nrf2和HO-1的蛋白表达水平越高。 第二部分: 1.Nrf激动剂+PQ组大鼠肺泡相对完整,有少量免疫细胞浸润。PQ组和Nrf抑制剂+PQ组大鼠的肺组织的肺泡中存在大量的免疫细胞、红细胞,肺泡膜结构被破坏; 2.与PQ组和Nrf抑制剂+PQ组相比,Nrf激动剂+PQ组大鼠肺W/D比值显著低于PQ组和Nrf抑制剂+PQ组,且差异具有统计学意义(P＜0.05); 3.ELISA显示与Nrf激动剂+PQ组相比,PQ组和Nrf抑制剂+PQ组大鼠肺组织中TNF-α和IL-1β的表达水平显著增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）; 4.与Nrf激动剂+PQ组相比,PQ组和Nrf抑制剂+PQ组大鼠血清中MDA的含量显著增高,差异具有统计学意义(P＜0.05),与Nrf激动剂+PQ组相比,PQ组和Nrf抑制剂+PQ组大鼠血清中SOD的活性显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）; 5.RT-PCR显示与PQ组相比,Nrf激动剂+PQ组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的mRNA表达水平明显增高,两组差异具有统计学意义(P＜0.05); 6.免疫组化结果均显示与PQ组相比,Nrf激动剂+PQ组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平明显增高,两组差异具有统计学意义(P＜0.05); 第三部分: 1.在PQ组和PQ+生理盐水组大鼠的肺组织的肺泡中存在大量的免疫细胞,肺泡膜结构被破坏,肺泡内充满大量的红细胞,PQ+SFN组大鼠的肺泡结构完整性得到显著改善,免疫细胞的含量较PQ组也显著减少; 2.ELISA显示PQ+SFN组肺组织中TNF-α和IL-1β的表达水平比PQ组和PQ+生理盐水组大鼠肺组织中表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.05); 3.ELISA显示PQ+SFN组大鼠肺组织中的8-OhdG水平显著低于PQ+生理盐水组(P＜0.05）; 4.PQ+SFN组血清中MDA的含量水平比PQ组和PQ+生理盐水组显著降低,PQ+SFN组血清中SOD的含量比PQ组和PQ+生理盐水组显著升高(P＜0.05); 5.RT-PCR显示PQ+SFN组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1和NQO1mRNA的表达水平比PQ组和PQ+生理盐水组显著增加（P＜0.05）; 6.Western-blot、免疫组化显示PQ+SFN组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表达水平比PQ组和PQ+生理盐水组显著增加(P＜0.05); 7.流式细胞术显示PQ+SFN组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1和NQ01蛋白的表达水平比PQ组和PQ+生理盐水组显著增加（P＜0.05）。 结论:在第一部分研究中,我们证实了PQ中毒大鼠肺损伤后会激活机体的炎症反应,促进免疫细胞的渗透,介导了肺组织中TNF-α和IL-1β的过量表达,破坏了大鼠体内的氧化还原平衡,这个过程中伴随Nrf2/ARE通路的激活,Nrf2和HO-1的表达水平明显增高。在第二部分研究中,我们证实了Nrf/ARE信号能够抑制PQ中毒导致的肺炎症反应,抑制免疫因子的释放,维持大鼠体内的氧化还原平衡。在第三部分研究中,我们证实了SFN处理能够通过激活Nrf2/ARE信号通路来改善PQ毒性导致的氧化应激损伤。我们的研究证实了Nrf2/ARE信号通路在机体抵抗PQ诱导的急性肺损伤中的重要调节作用,该通路能够显著抑制PQ诱导的细胞内氧化应激反应。SFN处理能够通过激活Nrf2/ARE信号通路来改善PQ毒性导致的氧化应激损伤。本研究还发现了SFN干预PQ肺损伤的分子机制,也为临床上应用SFN治疗急性百草枯中毒时的肺损伤提供了理论基础和新的方向。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

前言

第一部分Nrf2/ARE通路在大鼠急性百草枯中毒后肺组织动态表达研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二部分Nrf2/ARE信号通路在百草枯中毒肺损伤中的作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第三部分莱菔硫烷治疗急性百草枯中毒大鼠肺损伤的分子机制研究

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

综述：百草枯中毒致急性肺损伤的研究进展

致谢

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