声明
摘要
缩略词表
1．1乳酸菌简介
1．1．1干酪乳杆菌
1．1．2乳酸乳球菌
1．2乳酸菌基因工程进展
1．3乳酸菌基因组编辑系统
1．3．1传统的乳酸菌基因组编辑技术
1．3．2现代乳酸菌基因组编辑技术
1．4乳酸菌基因组编辑系统的应用
1．4．1乳酸菌基因组编辑系统在发酵食品领域的应用
1．4．2乳酸菌基因组编辑系统在益生菌上的应用
1．4．3乳酸菌基因组编辑系统在细胞工厂上的应用
1．4．4乳酸菌基因组编辑系统在生物治疗上的应用
1．5本论文的研究内容
第二章干酪乳杆菌原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的挖掘及其在基因组编辑中的应用
2．1材料与方法
2．1．1菌株、质粒与生长条件
2．1．2培养基与试剂
2．1．3生物信息学分析
2．1．4感受态细胞的制备及转化
2．1．5乳酸菌基因组DNA的提取
2．1．6载体构建
2．1．7LCABL_13040-50-60介导干酪乳杆菌BL23基因组编辑
2．1．8利用Cre／loxP系统切除氯霉素抗性基因
2．1．9 LCABL_13040-50-60介导其它乳酸菌的基因组编辑
2．1．10乳酸菌荧光强度测定
2．2结果
2．2．1 LCABL_13040-50-60的生物信息学分析
2．2．2 LCABL_13040-50-60在干酪乳杆菌BL23中的潜在重组功能研究
2．2．3 LCABL_13040和LCABL_13060的功能分析
2．2．4优化LCABL_13040-50-60介导的同源重组反应的条件
2．2．5 LCABL_13040-50-60和Cre介导干酪乳杆菌BL23基因的无缝敲除和插入
2．2．6 LCABL_13040-50-60介导干酪乳杆菌BL23基因组定点突变
2．2．7将LCABL_13040-50-60扩展到其它乳酸菌
2．3讨论
第三章基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的单质粒基因组编辑系统的构建及其在代谢工程中的应用
3．1材料与方法
3．1．1菌株、质粒与生长条件
3．1．2培养基与试剂
3．1．3感受态细胞的制备及转化
3．1．5载体构建
3．1．6干酪乳杆菌中单质粒基因组编辑系统的实施方案
3．1．7干酪乳杆菌中单质粒基因组编辑系统进行连续地基因敲除
3．1．8发酵条件及发酵产物分析方法
3．1．9统计学分析
3．2结果
3．2．1验证单质粒基因组编辑系统的可行性
3．2．2干酪乳杆菌中多个基因的连续删除
3．2．3工程菌株生产乙偶姻
3．3讨论
第四章结合LCABL_13040-50-60和Cre／loxP系统敲除干酪乳杆菌大片段基因组DNA
4．1材料与方法
4．1．1菌株、质粒与生长条件
4．1．2培养基与试剂
4．1．3感受态细胞的制备及转化
4．1．5线性双链DNA供体的构建
4．1．6 LCABL_13040-50-60介导的重组反应
4．1．7利用Cre／loxP系统敲除大片段基因组DNA
4．1．8生长曲线的测定
4．1．9乳酸菌荧光强度测定
4．2结果
4．2．1干酪乳杆菌中大片段基因组DNA的敲除策略
4．2．2干酪乳杆菌中大片段基因组DNA的无缝敲除
4．2．3干酪乳杆菌中含重要基因的大片段基因组DNA的无缝敲除
4．2．4干酪乳杆菌中同时敲除两个不连续的大片段基因组DNA
4．2．5干酪乳杆菌中大片段基因组DNA的连续敲除
4．3讨论
第五章干酪乳杆菌中靶向多拷贝基因组整合工具的建立及其在提高重组蛋白表达中的应用
5．1材料与方法
5．1．1菌株、质粒与生长条件
5．1．2培养基与试剂
5．1．3感受态细胞的制备及转化
5．1．4乳酸菌基因组DNA的提取
5．1．5载体构建
5．1．6 loxP位点定向插入染色体上
5．1．7外源基因插入到染色体上
5．1．8基因剂量测定
5．1．9染色体上基因的拷贝数测定
5．1．10乳酸菌荧光强度测定
5．1．11 Westernblot检测FaeG的表达量
5．1．12稳定性试验
5．1．13统计学分析
5．2结果
5．2．1干酪乳杆菌BL23中两步法基因组整合系统的构建
5．2．2染色体上插入位置对基因表达的影响
5．2．3“a"位点处gfp基因的多拷贝插入
5．2．4 FaeG蛋白的高表达
5．3讨论
第六章利用CRISPR／Cas9系统筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株
6．1材料与方法
6．1．1菌株、质粒与生长条件
6．1．2培养基与试剂
6．1．3感受态细胞的制备及转化
6．1．4基因组DNA的提取
6．1．5打靶质粒的构建
6．1．6检测原噬菌体的自发删除作用
6．1．7利用CRISPR／Cas9筛选原噬菌体删除株
6．1．8打靶质粒的消除
6．1．9菌株的抗胁迫能力分析
6．2结果
6．2．1 CRISPR／Cas9系统在干酪乳杆菌BL23中的功能分析
6．2．2确定原噬菌体自发删除的时间点
6．2．3 CRISPR／Cas9系统筛选原噬菌体删除株
6．2．4 CRISPR／Cas9系统有序筛选多个原噬菌体的删除株
6．2．5突变株L．casei BLP123的多态性检测
6．3讨论
第七章乳酸菌中反向筛选系统的建立及其应用
7．1材料与方法
7．1．1菌株、质粒与生长条件
7．1．2培养基与试剂
7．1．3生物信息学分析
7．1．4感受态细胞的制备及转化
7．1．6验证PheS*的致死性
7．1．7构建载体pleiss-nP-gfp
7．1．9乳酸乳球菌中pG+-nP-pheS*的功能分析
7．1．10将pheS*应用于干酪乳杆菌
7．2结果
7．2．1 PheS蛋白序列的生物信息学分析
7．2．2乳酸乳球菌中反向筛选标记Pdh-pheS*的功能分析
7．2．3乳酸乳球菌中反向筛选标记5Pldh-pheS*的建立
7．2．4乳酸乳球菌中基因敲除系统PheS*／pG+host9功能分析
7．2．5 pheS*在其它乳酸菌中的应用潜力
7．3讨论
全文总结与展望
参考文献
攻读博士期间已(待)发表的论文
致谢
外文写作
