声明
摘要
符号说明及缩写词
第一章文献综述
1．1分子伴侣GroEL
1．1．1 GroEL的结构和功能
1．1．2辅伴侣蛋白GroES
1．1．3 groELs的调控机制
1．2基因重复
1．2．1基因重复的概念和产生机制
1．2．2重复基因的演化类型
1．2．3基因重复对表达的影响
1．3粘细菌及其大基因组
1．3．1粘细菌概述
1．3．2粘细菌的大基因组及重复基因
1．4 CheY蛋白及其所属双组分系统
1．4．1 CheY蛋白功能概述
1．4．2 CheY蛋白所参与的双组份系统
1．5本课题开展思路
第二章双拷贝GroELs和单拷贝GroES的功能和表达关系
2．1．1菌株与质粒
2．1．2引物
2．1．3培养基
2．1．4实验试剂
2．1．5仪器设备
2．2实验方法
2．2．1生物信息学分析groEL和groES基因的存在情况
2．2．2 groES基因的敲除
2．2．3 groES基因异位回补后再敲除
2．2．4 groEL2基因前插入groES基因
2．2．5通过pZJY41质粒构建groES过表达突变株
2．2．6蛋白异源表达与纯化
2．2．7 ATP酶活检测
2．2．8 MDH复性实验
2．2．9蛋白Pull-down实验
2．2．10非变性凝胶电泳(Native PAGE)
2．2．11体内助溶实验
2．2．12荧光定量PCR(q-PCR)
2．2．13热激反应
2．2．14统计学分析
2．3结果与讨论
2．3．1所有已完整测序细菌中groEL与groES基因的分布情况
2．3．2已完整测序的粘细菌中groEL与groES基因的分布情况
2．3．3单拷贝groES基因对菌株存活的必要性
2．3．4体外GroELs对GroES的依赖性
2．3．5体内GroELs对GroES的依赖性
2．3．6双拷贝groELs与单拷贝groES的协同表达
2．3．7 groES的过表达会同时使双拷贝groELs上调
2．3．8人工构建的groESL2操纵子对groES和groEL的表达无影响
2．4本章小结
第三章双拷贝groEL基因的调控机制
3．1实验材料
3．1．1菌株与质粒
3．1．2引物
3．1．3培养基
3．1．4实验试剂
3．1．5仪器设备
3．2实验方法
3．2．1 CIRCE元件的组成和位置分析
3．2．4荧光定量PCR(q-PCR)
3．2．5生物信息学分析HrcA蛋白的保守结构和位点
3．2．6 HrcA蛋白的纯化
3．2．7 Electrophoretic mobility shift assays(EMSAs)
3．2．9 Western blot检测HrcA和σ32蛋白的表达
3．2．10荧光强度测定
3．3．2 groESL1和groEL2启动子区的差异
3．3．3不同高GC菌株中CIRCE元件的位置及组成
3．3．4 hrcA和σ32突变株中各相关基因的表达情况
3．3．5 HrcA蛋白与CIRCE元件的结合力
3．3．6基于两种调控因子构建的大肠杆菌体内转录系统
3．4本章小结
第四章MXAN_4468蛋白对groELs的影响及作用机制
4．1实验材料
4．1．1菌株与质粒
4．1．2引物
4．1．3培养基
4．1．4实验试剂
4．2．4表型分析
4．2．5 TA(myxovirescin)发酵水平的测定
4．2．6关键位点突变表达载体及突变株的构建
4．2．7 Phos-tag PAGE
4．2．8 pull-down钓取潜在结合蛋白
4．3结果与讨论
4．3．1 CheY同源蛋白编码基因在粘细菌中的分布
4．3．2 MXAN_4468蛋白的结构特征和进化关系
4．3．3 MXAN_4468蛋白对groES和groELs转录的影响
4．3．4 MXAN_4468对菌株表型和TA发酵水平的影响
4．3．5 MXAN_4468蛋白关键位点的突变
4．3．6蛋白质谱鉴定MXAN_4468蛋白的pull-down产物
4．3．7MXAN_4468与HrcA的关系
4．4本章小结
全文总结与展望
附录
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文
