莱芜猪心脏组织cDNA文库的构建及部分表达序列标签的分析

摘要

莱芜猪是我国地方名猪,具有五千多年的悠久历史,具有繁殖性能高、抗逆性强、肉质优良、耐粗食、杂交优势明显等特点。目前,以莱芜猪为原料,开发冷鲜肉、烤肉、香肠三大系列20多个类型的肉制品,已在省内外形成良好的品牌效应,产品销往全国各地,备受消费者青睐。可以预计莱芜猪的市场空间大,发展前景广阔。因而,合理地开发利用和有效的保护这一珍稀的遗传资源具有重要的理论和应用研究价值。
　　 本研究以莱芜猪为供试材料,用改进的异硫氰酸胍法提取心脏组织总RNA,通过SMART技术反转录成单链cDNA,以长距离PCR法合成双链cDNA；PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,用SfiⅠ酶切；将酶切产物分级分离,回收大于0.5 kb的cDNA片段,并与λTrip1Ex2载体连接；连接产物经体外包装,形成莱芜猪心脏组织原始文库,其文库滴度为2.0×105pfu／mL,重组率为94.4％。原始文库扩增后获得扩增文库,检测滴度为3.0×100 pfu／mL。随机挑取重组克隆感染大肠杆菌BM25.8,使λ噬菌体cDNA文库质粒化,形成pTrip1Ex2。再从转化的平板上随机挑取克隆菌落,依载体两端序列设计引物,进行PCR扩增,结果显示大部分克隆的插入片段长度在0.75 kb以上。
　　 从扩增文库中随机挑取重组克隆进行5ˊ和3ˊ测序,获得8条有效的EST,长度在244～711 bp之间,分析8个克隆的ESTs序列所包含的ORF,并进行BLASTp比对,推断其相关的功能。结果表明,LW13、LW15、LW16、LW17克隆的最长ORF均不完整,数据库中无与其匹配的蛋白质序列,推测可能为新基因的一部分；LW19克隆的最长ORF为609 bp,编码202个氨基酸,分子量为22.4 kD,该蛋白质序列含有硫氧还蛋白保守结构域,推测与维持体内稳定的氧化还原状态有关；LW20克隆的最长ORF为198 bp,编码65个氨基酸；LW22克隆的最长ORF为105 bp,仅编码34个氨基酸；LW24克隆的最长ORF不完整。在数据库中,均未发现与LW20、LW22和LW24三个克隆相匹配的蛋白质序列,推测可能为新基因的一部分。
　　 经BLASTx和BLASTn两个方面的综合比对分析,说明LW19和LW22两个克隆的EST编码的氨基酸序列可能在细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡以及机体免疫等基础研究中具有一定的理论意义,对研究莱芜猪某些优良性状的表现机理也起到非常重要的作用,为后续工作的开展也做了重要的铺垫。
　　 通过SMART技术构建莱芜猪心脏组织cDNA文库,不仅保存了稀有的地方种猪遗传资源,而且为莱芜猪有明确功能的特异基因的克隆、表达以及新基因的筛选与功能研究提供依据。

目录

文摘

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课题来源

主要缩略语

第一章 绪论

1.1 莱芜猪的研究进展

1.1.1 莱芜猪的生物学特性

1.1.2 莱芜猪的发展前景

1.1.3 莱芜猪的保护与利用

1.2 基因文库

1.2.1 基因组文库

1.2.2 cDNA文库

1.3 EST技术及应用

1.3.1 EST的概念及原理

1.3.2 EST技术及其应用

1.4 研究进展及意义

第二章 莱芜猪心脏组织cDNA文库的构建

2.1 实验材料

2.2 仪器和药品

2.2.1 实验仪器

2.2.2 主要药品及试剂

2.2.3 溶液的配置

2.3 方法

2.3.1 莱芜猪心脏组织总RNA的提取

2.3.2 总RNA质量及完整性检测

2.3.3 cDNA合成技术路线

2.3.4 cDNA第一链的合成

2.3.5 双链cDNA的合成

2.3.6 双链cDNA蛋白酶K消化

2.3.7.Sfi Ⅰ酶切

2.3.8 双链cDNA的分级分离

2.3.9 cDNA与λTriplEx2的连接与包装

2.3.10细菌培养平板的制备

2.3.11原始文库滴度及重组率的测定

2.3.12文库的扩增

2.3.13扩增文库滴度及重组率的测定

2.3.14 λTriplEx2转化为pTriplEx2

2.3.15插入片段大小测定

2.4 结果

2.4.1 总RNA的提取与纯化

2.4.2 双链cDNA的合成

2.4.3 CHROMA SPIN-400凝胶过柱分离

2.4.4 原始文库滴度及重组率的测定

2.4.5 扩增文库滴度及重组率的测定

2.4.6 插入片段大小

2.5 讨论

2.5.1 文库质量评价

2.5.2 cDNA文库的完整性

2.5.3 影响文库质量的因素

2.5.4 载体的特点

第三章 莱芜猪心脏组织随机测序及部分表达序列标签的分析

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 试剂

3.2 方法

3.2.1 λTriplEx2转化为pTriplEx2

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 数据处理与分析

3.3 结果与分析

3.3.1 测序结果分析

3.3.2 相似性结果分析

3.4 讨论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢